ניתוח סיבי דנ"א מאפשר לנו להבין כיצד ננו-חומרים משפיעים על דנ"א ברמה מולקולרית יחידה. ומידע זה יאפשר לפתח אסטרטגיות שיפחיתו את הננו-רעילות. טכניקה זו מאפשרת לנו להבין את הדינמיקה של הדנ"א וכיצד היא מושפעת כאשר תאים או רקמות נחשפים לגורמים מזיקים לדנ"א, אקסוגניים או אנדוגניים, ואנו יכולים להסתכל על שכפול דנ"א, תיקון דנ"א ודינמיקה של כרומטין. חקר דינמיקת שכפול הדנ"א ומנגנון התיקון יסייע בפיתוח אסטרטגיות שישפרו את יעילות החומר הטיפולי או יפחיתו את ההשפעה מחוץ למטרה של ננו-רפואה.
מה שאנחנו באמת רוצים שאנשים ידעו על הטכניקה הזאת הוא שזה הדברים השונים שאנחנו יכולים או אדם אחד יכול לעשות. אחת מהן היא להבין כיצד חומרים כימותרפיים חדשניים יכולים להשפיע על בריאות התא, לראות אם אתה יכול להרוג אותם מהר יותר או ביעילות רבה יותר. הדבר הבא הוא לחשוב על כאשר אתה מוסיף סוכן, נניח שזה סוכן טיפולי או תרופתי חדש, אתה רוצה לדעת אם זה הולך לפגוע באדם לפני שאתה נותן לו את זה.
לכן, אתה יכול פשוט לתת את הסוכן לתאים או למערכות מודל ולראות אם זה פוגע בתאים או במערכת המודל, ואם כן, כמה? הדבר הבא הוא להסתכל, אנחנו מפתחים את כל הננו-תרופות החדשות האלה ואנחנו רוצים לוודא שהננו-תרופות האלה לא פוגעות באדם או במקום שבו אנחנו מזריקים את הננו-רפואה. הדבר האחרון הוא שלפעמים אתם רוצים לדעת כיצד חלבון משפיע על שכפול דנ"א, תיקון דנ"א או דינמיקה של כרומטין, ואנו יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי להיות מסוגלים לעשות זאת.
זוהי שירלי פאטל, סטודנטית לתואר שני במחקר ביוטכנולוגיה רפואית במעבדה שלי, תדגים את ההליך. התחל את הכנת בדיקת הסיבים על ידי הסרת המדיום מ- 75% ל- 80% תאי מקרופאג RAW 264.5 וחלוקתו לשני חצאים. שמור מחצית אחת עבור הדופק chloro-iododeoxyuridine או chloro-iododeoxyuridine מילואים ולהוסיף חמישה מיקרוליטר של iododeoxyuridine לחצי השני, מה שהופך 50 מיקרומול כמו הריכוז הסופי.
לאחר הערבוב, מוסיפים את המדיום המכיל יודאוקסיורידין בחזרה לצלחות ומניחים את התאים באינקובטור למשך 20 דקות. מראש לחמם את chloro-iododeoxyuridine מילואים בינוני ב 37 מעלות צלזיוס ולהוסיף chloro-iododeoxyuridine למדיום זה לפני הדופק chloro-iododeoxyuridine. לאחר 20 דקות, שאפו את התערובת הבינונית יודודאוקסיורידין מבקבוק תא המקרופאג RAW 264.5.
לשטוף בעדינות את התאים עם 500 מיקרוליטר של PBS, שיש 7.4 pH, ולסובב את הצלחת לפני השלכת PBS. לטפל בתאים עם ריכוזים שונים של חלקיקי תחמוצת גרפן ב 500 מיקרוליטר של המדיום לדגור במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, שאפו את התערובת הטיפולית-בינונית ושטפו בעדינות את התאים עם 500 מיקרוליטר PBS על ידי סיבוב עדין של הצלחת לפני השלכת PBS.
לאחר מכן, להוסיף חמישה מיקרוליטרים של chloro-iododeoxyuridine למדיום כלורו-iododeoxyuridine מילואים, ולכסות את התאים עם chloro-iododeoxyuridine מילואים בינוני. עבור הדופק chloro-iododeoxyuridine, מניחים את התאים באינקובטור למשך 20 דקות. לאחר שטיפת PBS, גרדו את התאים במשך שלוש עד ארבע דקות, ואז הוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום לצלחת ואספו את התאים.
צנטריפוגה את התאים שנאספו ב 264G במשך ארבע דקות. הסר את supernatant ו resuspend את התאים במיליליטר אחד של PBS קר כקרח. כדי להכין את סיבי הדנ"א, תייגו את שקופיות הזכוכית עם תנאי הניסוי והתאריך, באמצעות עיפרון.
שואפים שני מיקרוליטרים של תאים בפיפטה ומחזיקים את הפיפטה בזווית של כ-45 מעלות. לאחר מכן מקם את הפיפטה כסנטימטר אחד מתחת לתווית השקופית והזז את הפיפטה אופקית לכיוון תווית השקופית עם שחרור איטי של תמיסת התא. ברגע שהתמיסה מתאדה ונראית דביקה ודביקה, כיסו כל שורה של תאים ב-15 מיקרוליטר של חיץ ליזה מבלי לתת לקצה הפיפטה לגעת במגלשה.
לאחר מכן הטו את המגלשה בזווית של 25 מעלות ואפשרו להתפשטות הדנ"א להתייבש באוויר למשך ארבע שעות לפחות. ביום הראשון, תקן את סיבי ה- DNA על ידי טבילת המגלשות בחומצה אצטית מתנול למשך שתי דקות. ביום השני, הניחו את המגלשות במנשא מגלשות זכוכית ודגרו עליהן בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות.
כדי לנטרל את הדנ"א, הכינו תא לח והכניסו את המגלשות בזהירות לצנצנת קופלין המכילה מים שעברו דה-יוניזציה, או DI, כדי להבטיח שהמשטחים המצופים לא ייגעו בדפנות הצנצנת. לאחר 20 שניות של דגירה, לשפוך את המים. מוסיפים לצנצנת קופלין 2.5 חומצה הידרוכלורית מולרית, ומכסים את כל המגלשות.
לאחר 80 דקות של דגירה, יש לתת שטיפה אחת עם PBS בתוספת 0.1% Tween, ואחריה שתי שטיפות עם PBS למשך שלוש דקות כל אחת בטמפרטורת החדר. לצביעת מערכת החיסון, הניחו את המגלשות בתא הלח וחסמו אותן באמצעות אלבומין בסרום בקר 5%, או BSA, ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן כסו את השקופיות בגיליון פלסטיק שקוף.
לאחר החסימה, הסירו את חלקת הכיסוי והוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים הראשונית לאורך ההחלקה. הוסיפו מכסה פלסטיק חדש והמתינו שעתיים. לאחר שעתיים, הורידו את תמיסת הנוגדנים ושטפו את המגלשות בצנצנת קופלין מלאה ב-PBS פעמיים.
חסום שוב את השקופיות על-ידי הוספת 200 מיקרוליטר של 5% BSA לאורך השקופית. מוסיפים מכסה פלסטיק ודוגרים במשך 15 דקות. לאחר הסרת תלוש הכיסוי והסרת עודפי BSA באמצעות מגבת נייר, מוסיפים 100 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים המשנית לאורך המגלשה ומניחים פתק כיסוי פלסטיק חדש.
לאחר שעה, הסירו את תלוש הכיסוי, הורידו את עודפי ה-BSA על מגבת נייר ושטפו את המגלשות פעמיים ב-PBS. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים שלישוני לאורך ההחלקה ומניחים מכסה פלסטיק חדש. שוב, הוסיפו 200 מיקרוליטר של 5% BSA לאורך כל שקופית ודגרו במשך 15 דקות.
לאחר שלוש שטיפות עם PBS, הסירו את עודפי PBS ואפשרו להם להתייבש לחלוטין. לאחר הייבוש, הוסיפו את אמצעי ההרכבה על המגלשה והניחו את החלקות כיסוי הזכוכית מבלי לאפשר היווצרות בועות. דמיינו את סיבי הדנ"א המוכתמים במערכת החיסון באמצעות מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי המצויד במצלמה, מטרה של 60x וערכות סינון מתאימות לזיהוי צבעי Alexa Fluor 488 ו-594.
השונות בדפוסי השכפול לאחר חשיפה ארוכת טווח לננו-חומרים נקבעה על ידי השוואת דפוסי השכפול של תאים לפני ואחרי החשיפה לננו-חלקיקים יודאוקסיורידין וכלורו-יודאוקסיורידין. ניתוח סיבי דנ"א ותמונות פרשנות חשפו דפוס לתאי מקרופאגים בקרה ולדנ"א מקרופאגים המטופלים בגרפן-תחמוצת-ננו-חלקיקים. השונות נצפתה בדפוס של מתווכי השכפול, והראתה עלייה במקורות חדשים באזור אחר של אותו מצב.
נתוני הסיבים החד-משמעיים התקבלו על ידי חלוקת השטח הכולל של השקופית לחמישה עד שישה אזורים וצילום תמונות מרובות מכל אזור. בחירת כ-500 מתווכים מתוך מספר שקופיות או תנאים הייתה אידיאלית כדי לחקור את השונות בדינמיקת שכפול הדנ"א. הניתוח הצביע גם על עלייה במסלולים האדומים בלבד, מה שמצביע על קביעות וירידה במקורות החדשים שנורו בתאים שטופלו בתחמוצת הגרפן בהשוואה לקבוצת הביקורת.
איכות התפשטות סיבי הדנ"א תלויה במידת ההתפשטות של הסיבים זה מזה ושהם אינם חופפים. לאחר שהסיבים נפרסו ו-IdU ו-CldU הוכתמו, חשוב מאוד למצוא את סיבי הדנ"א. אחד הדברים שאתם יכולים לעשות אחרי שאתם מייצרים את סיבי הדנ"א הוא, אחד, אתם יכולים להסתכל על האופן שבו דינמיקת השכפול מושפעת.
שנית, אתם יכולים להסתכל היכן ממוקם נזק לדנ"א ביחס למסלולי שכפול הדנ"א. והדבר האחרון הוא שאם אתם משתמשים בבדיקות FISH, אתם יכולים למעשה להסתכל על אזורים ספציפיים וכיצד הם מושפעים מהנזק הזה לדנ"א. טכניקה זו סוללת את הדרך לפיתוח תרופות כימותרפיות, תכנון תרופות והבנה כיצד שכפול DNA מושפע מסוגים שונים של חלבונים.
