גישה פוטודינמית לחקר תפקוד קרע שלפוחית תוך תאית

אנדוציטוזה של שלפוחית לתוך ציטופלזיה גורמת להיווצרות שלפוחיות תוך תאיות. חדירה של שלפוחית מפעילה מסלולי אות שונים. השבתת לייזר בסיוע כרומופור משמשת לחקר התוצאה של קרע שלפוחית תוך תאית.

בקרה מרחבית וזמנית של נזק תת-תאי לשלפוחיות תוך-תאיות יכולה להיות מושגת על ידי התאמת מצב העמידה ותאורת האור. כדי להתחיל, לשמור על תרבית תאי HeLa ב DMEM בתוספת 10% FBS. לאחר שטיפת התאים עם PBS, טריפסיניזציה של התאים.

לאחר מכן להשעות מחדש את התאים ב- DMEM בתוספת 10% FBS. לדלל 300 ננוגרם של פלסמיד Gal3-GFP ב 25 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת. לאחר מכן להוסיף 0.6 מיקרוליטר P3000 מגיב.

ולערבב בעדינות, ולאחר מכן מערבלים את התמיסה. לדלל 0.45 מיקרוליטר של מגיב Lipofectamine 3000 ב 25 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת בעדינות. דוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן מערבבים DNA מדולל וליפופקטמון 3000 מדולל ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ערבוב תערובת ה- DNA lipofectamine, 300, 000 תאי HeLa מרחפים ו -200 מיקרוליטר DMEM עם 10% FBS, זרעו את התאים באזור הזכוכית המרכזי של צלחת כפתור זכוכית 35 מ"מ. כדי לאפשר חיבור תאים, יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור המסופק עם 5% פחמן דו חמצני למשך ארבע שעות לפחות.

לדלל AlPcS2a ב- DMEM בתוספת 10% FBS כדי ליצור פתרון AlPcS2a מיקרומולרי אחד. חממו מראש את המדיום המכיל AlPcS2a באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס והחליפו את מדיום התרבית בתווך המכיל AlPcS2a. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור המסופק עם 5% פחמן דו חמצני למשך הלילה.

למחרת, שטפו את התאים פעמיים עם PBS כדי להסיר AlPcS2a חוץ-תאי לאחר החלפת המדיום במדיום טרי. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות כדי לאפשר לשאריות צבע לאורך המסלול האנדוציטי להצטבר לליזוזומים. כדי לתפעל תאים בודדים על ידי פגיעה בליזוזומים, הניחו את צלחת התרבית על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי.

השתמש בלייזרים בגודל 488 ננומטר ו- 561 ננומטר לקבלת GFP ו- AlPcS2a מלהיבים, בהתאמה. הקף אזור מרובע בגודל חמישה על חמישה מיקרומטר של עניין על שלפוחיות המסומנות ב- AlPcS2a שנבחרו להינזק. ואז פולס להאיר את האזור של עניין עם לייזר 633 ננומטר של 0.21 מילי וואט, או 70 חזרות.

עקוב אחר היווצרות Gal3 puncta כאינדיקטור לחדירת קרום ליזוזומלי. צביעה ליזוזומלית עם AlPcS2a בתאי HeLa בוצעה באמצעות סמנים זמינים מסחרית, ונצבעו באופן חיובי בצבע פלואורסצנטי ירוק. ליזוזומים בתאי TagRFP-Galectin3 המבוטאים ב-HeLa היו מוכתמים ב-AlPcS2a.

לאחר מכן הארה ממוקדת עם אור אינפרא אדום קרוב, התוצאות מצביעות על כך שהפעלת לייזר בסיוע כרומופור מבוססת AlPcS2a הצליחה לשלוט בקרע ליזוזומלי מקומי באזור העניין, והשאירה את שאר הליזוזומים ללא פגע. שלב זה חשוב מכיוון שזמן הדגירה יקבע אנדוזומים עומדים או ליזוזומים. לדוגמה, אנשים יכולים לקבוע את הגודל של על ידי שחרור של צבע בלתי חדיר קרום.

כמו כן ניתן להשתמש בצבעים רגישים ל- pH כגון FITC dextran כדי להבדיל בין אנדוזומים וליזוזומים. טכניקה זו שימושית החל את ההשפעות במורד הזרם של קרע קרום שלפוחית תוך תאית. ויש השפעות במורד הזרם במצבים שונים.