הפרוטוקול מציג טכניקות מיקרוסקופיה מגוונות המיושמות כדי להבין את ההתיישבות הפטרייתית בצמחים מיקוהטרוטרופיים, החל מאיסוף וכלה בהכנת דגימות בפירוט וכוללות שלבים חיוניים. טכניקות כאלה יכולות להיות מיושמות על צמחים מיקוהטרוטרופיים שונים, ואפילו על חומרים של צמח שאינם mycoheterotrophics. שיטה זו קשורה בעיקר לבוטניקה מבנית ויכולה גם לספק תובנות על אינטראקציות מיקוריזאליות, פיזיולוגיה, ביולוגיה של הרבייה, אבולוציה ואקולוגיה של צמחים מיקוהטרוטרופיים.
כדי להתחיל, לאסוף את הצמחים mycoheterotrophic על ידי חקירת הקרקע סביב בסיס הצמח, נזהר לא לפגוע באיברים תת קרקעיים. כמו כן, הימנעו ממשיכת הצמחים מהקרקע כדי למנוע ניתוק האיברים האוויריים מהתת-קרקעיים. בזהירות, חפרו סביב מבנים אוויריים באמצעות תרנגולת גינון תוך כדי חקר האיברים התת-קרקעיים כמו שורשים, גבעולים, קני שורש ואיברי אחסון מבלי לפגוע במבנים אלה.
הסר חלקיקי אדמה כדי לשמר מבנים שבירים ושטוף בעדינות איברים אלה במי ברז כדי לשטוף את חלקיקי הקרקע הנותרים לפני תיקון הדגימות. צמחים מיקוהטרוטרופיים הקשורים לפסולת עלים דורשים תשומת לב נוספת. לפיכך, לאסוף בזהירות את האיברים העדינים המחוברים לחומר המתפרק באמצעות המקף שלהם מבלי למשוך אותם מהמבנים המחוברים.
לשמר מבנים עם קשרים כאלה ולאסוף את המלטה לניתוח. לצורך ניתוח מיקרוסקופיית אלקטרונים, יש לחלק את הדגימות בעובי 3 עד 4 מילימטרים בתוך טיפה של חיץ נתרן קקודילאט גלוטראלדהיד למקטעים קטנים יותר בעובי של 1 עד 2 מילימטרים. השליכו את הקצוות החתוכים מחוץ לטיפה.
הקפידו על ביצוע תהליך הקיבוע באתר האיסוף מיד לאחר איסוף הצמחים. מיד להעביר את החלקים לצינור איסוף עם נפח של fixative יותר מ 10 פעמים גדול יותר מאשר נפח של דגימות כפי שהוא מקבע תוסף. לניתוח פני השטח של הקורים השטחיים באיברים, במיוחד אלה התת-קרקעיים ואלה הבאים במגע עם פסולת עלים.
שימו לב לחומר טרי או קבוע מתחת למיקרוסקופ המנתח בהגדלה של פי 7.5 ומעלה. חפש את תחומי העניין המונחים על ידי hyphae שטחי ואת rhizomorphs. בחר את הדגימות המכילות אזורים של ריזומורפים שטחיים מכיוון שניתן לחלק אותם כדי לדמיין פלוטונים וסלילי hyphae בתוך תאי קליפת המוח בשורשים ובגבעולים.
הכינו 0.2 מיליגרם למיליליטר של נבט חיטה אגלוטינין פלואורוכרום מצומד ותמיסות לבנות של 1% קלקופולור במאגר פוספט טוחן 0.1 כמתואר בכתב היד של הטקסט. עכשיו, לדגור את החלקים על שקופיות זכוכית על ידי כיסוי כראוי עם נבט חיטה agglutinin fluorochrome מצומד פתרון במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את החלקים עם 0.1 טוחנת פוספט חיץ לדגור אותם בתמיסת calcofluor כמדיום הרכבה.
לאחר מכן, הנח את החלקות הכיסוי על השקופיות והתבונן בהן תחת מיקרוסקופ אור קונפוקלי או פלואורסצנטי באמצעות המסננים שצוינו. לאחר תיקון הדגימות, ביצוע התייבשות ואחסונן ב-70% אתנול, יש לחשוף כל משטח רצוי לסריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים על ידי שימוש בסכין גילוח חד וחדש לביצוע חתכים בתנועה חד-כיוונית. במידת הצורך, השתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי לבחור את הדגימות ולהתחשב באזור גושי המתכת בעת קביעת גודל הדגימה.
יתר על כן, לייבש את הדגימות בסדרה אתנולית. שמרו דגימות קטנות ועדינות למשך 30 דקות בכל ריכוז ודגימות גדולות וצפופות יותר למשך שעה. לאחר מכן, קפלו מעטפות קטנות באמצעות נייר טישו כדי לארגן דוגמאות לשלבים הבאים.
ניתן לטפל בדגימות גדולות יותר ללא מעטפה. תייג את המעטפות באמצעות עיפרון ונהל יומן של הדגימות. בזהירות הניחו את הדוגמאות בתוך המעטפות בעזרת מכחול.
עכשיו, לשמור את הדגימות האלה אתנול מוחלט. המשך מיידי בייבוש נקודתי קריטי על ידי הפעלת מייבש נקודה קריטית על פי נהלי ההפעלה הסטנדרטיים. לשם כך, הניחו את הדגימות באתנול מוחלט במחזיק דגימה והניחו אותו בתוך תא הלחץ של מייבש הנקודות הקריטיות.
נוזל הביניים מתמוסס לתוך נוזל המעבר בנקודת הפחמן הדו-חמצני הקריטית, ובכך מייבש את הדגימות. מכיוון שספיגה מחדש של לחות אטמוספרית יכולה להרוס את הדגימות, אחסנו אותן במיכל ייבוש מיד לאחר ייבוש בנקודה קריטית. לפני הרכבת הדגימות על stubs מתכת, לשים את הכפפות על מנת לתפעל את stubs.
לטבול אותם אצטון במשך 5 דקות כדי לחסל כל שומן ולתת להם להתייבש. תחת מיקרוסקופ סטריאו, תקן את הדגימות על המוט באמצעות סרט דבק פחמן דו-צדדי מוליך ומקם אותן. האתר מלמעלה הוא הפרספקטיבה היחידה האפשרית בסריקת תמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים.
כדי לתפעל את הדגימות, השתמש בפינצטה נקודה עדינה. החלק לדוגמה נגע על ידי פינצטה הוא פגום בדרך כלל. אז היזהר ונסה לגעת בחלקים הממוקמים הרחק מתחומי העניין.
מתחזקים את הסטוצים עם דגימות בצלחת פטרי אטומה עם ג'ל סיליקה. לאחר מכן, המשך עם ציפוי sputter כדי להפקיד שכבה של זהב או פלטינה על פני השטח של דגימות באטמוספירה בלחץ נמוך של גז אינרטי על ידי ביצוע נהלי ההפעלה הסטנדרטיים. עובי הציפוי תלוי בטופוגרפיה של הדגימה והוא בדרך כלל בין 15 ל-40 ננומטר.
לבסוף, שמרו על השקעים המצופים בצלחת פטרי אטומה עם ג'ל סיליקה השומר על הלחות. ניתן לאחסן את הדגימות בדרך זו במשך שבועות. השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לנתח דגימות אלה.
קרן אלקטרונים פוגעת בדגימת ה-in vacuo במהלך סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים ופליטת האות מאינטראקציה כזו מתפרשת כתמונות. ודא שהתמיסות והחומרים המשמשים לנביטה סימביוטית של זרעים הם סטריליים. כדי למנוע זיהום.
התחל על ידי autoclaving אותם במשך 20 דקות ב 121 מעלות צלזיוס. במכסה מנוע זרימת אוויר למינרי, יש לחטא באופן שטחי את הפירות והזרעים על ידי טבילתם בתמיסת נתרן היפוכלוריט המכילה 2% כלור פעיל. זרעים דקים ושבירים ניתן לטבול בתמיסת נתרן היפוכלוריט מדולל ביחס של 1:1.
לאחר החיטוי משחזרים את הזרעים על ידי סינון שלהם באמצעות בד זירוגרפי. שטפו את הפירות והזרעים שלוש פעמים במים מזוקקים כדי להסיר את תמיסת ההיפוכלוריט לפני שתמשיכו בבדיקות הנביטה. במידת הצורך, אחסנו אותם במעטפות נייר סינון בתוך צלוחיות זכוכית עם ג'ל סיליקה ב -4 מעלות צלזיוס וסגרו הרמטית את הצלוחיות ואטמו אותן בסרט נצמד, ואז העריכו את יעילות תהליך הכביסה על ידי העברת כמה טיפות מים מהכביסה האחרונה לאגר דקסטרוז תפוחי אדמה.
לנביטה סימביוטית של זרעי סחלבים, דגרו את הזרעים מעל דיסקיות נייר סינון אוטומטיות בגודל 1 עד 2 ס"מ שהונחו בצלחות פטרי המכילות מדיום תרבית אגר שיבולת שועל. כעת, חסן את מרכז צלחת הפטרי עם שבר של מדיום תרבית המכיל תפטיר מהפטרייה המבודדת שנבחרה. אוטמים את צלחות הפטרי עם סרט נצמד ודוגמים אותן בחושך בסביבות 25 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת החדר, תלוי בצמיחת הפטריות.
הכן כמה מנות עם זרעים וללא חיסון פטרייתי כמו שליטה שלילית עבור בדיקת נביטה. נתח את תוצאות הנביטה מדי שבוע על ידי איסוף נתונים כמותיים ואיכותיים וצילום פרוטוקורמים ושתילים. ניתן לזהות בקלות את הריזומורפים בדרך כלל כמבנים כהים, דמויי שרוך.
יד חופשית או שיטות אחרות להשגת מקטעים בעובי של יותר מ-10 מיקרומטר יכולות להפיק טוב יותר פלוטונים ולספק תמונות מייצגות יותר של תבניות פטרייתיות של התיישבות. קטעי יד חופשית יכולים להתאים גם לניתוח hyphae בהגברה גבוהה יותר. אמנם, פרטים מושגים טוב יותר בחלקים דקים יותר.
ניתן לזהות בקלות את דפנות התא המשניות באלמנטים קסילם על ידי צבע האור שטולואידין רוכש. בינתיים, אלמנטים פלומיים המורכבים רק מדפנות התא הראשוניות מזוהים על ידי דפנות התא הדקות והכהות יותר שלהם. ממצאים על ידי אוטופלואורסצנציה ניתן לראות בקטעי שרף גליקול מתקרילט.
ממצאים אלה קשורים בדרך כלל לריכוז פלואורוכרום וניתן להימנע מהם על ידי שטיפת הדגימות מספר רב יותר של פעמים עם המאגר. החלק החופשי של השורש מציג מקף פנימי וחיצוני. ניתן לראות את אותו איבר על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים עם שפע של ריזומורפים וקורים בודדים על פני השטח שלו.
רוב מיני הסחלבים נובטים תוך מספר שבועות לאחר שנדבקו בפטרייה המחוסנת או עד כמעט יותר מחודש. אור במיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת יכול להיות מיושם על פרחים, פירות וזרעים כדי לחקור את ביולוגיית הרבייה או צמחים מיקוהטרוטרופיים. נביטה סימביוטית של זרעים יכולה להיבדק גם בסחלבים אוטוטרופיים.
