פרוטוקול SiMPull זה מאפשר כימות של זרחון חלבונים על ידי שיפור התוויית הנוגדנים ותנאי הקיבוע, הפחתת האוטו-פלואורסצנציה המצויה בתעלה הירוקה ומתן אלגוריתמים חזקים לניתוח מולקולות בודדות. היתרון העיקרי של SiMPull הוא שהוא מאפשר לנו לחקור את מצב הזרחון של חלבונים שלמים בודדים. בעזרת שיטה זו, אנו יכולים להשיג מידע חדשני שאינו נגיש באמצעות טכניקות מסורתיות, כגון כתם מערבי וניתוח מפרט מסה.
יש לנו צוות חוקרים שעוזר להדגים את הפרוטוקול. ראשית, ג'וליאן רוג'ו יראה כיצד לחרוט פיראנה את הכיסוי. לאחר מכן, רייצ'ל גרטן תציג את השלבים לציפוי זכוכית הכיסוי.
ואליזבת ביילי תראה כיצד לצייר את דוגמאות המערך והתמונה. כדי להתחיל, פיראנה חורטת את הכיסוי מחליק על ידי תסיסה עדינה של התגובה כל חמש דקות במשך 30 דקות. נטרל את פתרון הפיראנה על ידי הוספת בסיס חלש בהדרגה.
בעזרת מוט זכוכית, מעבירים את הכיסוי החרוט לתוך משפך בוכנר ושוטפים במשך חמש דקות במים מזוקקים כפולים. לאחר מכן מניחים את הכיסוי מחליק בצנצנת קופלין מזכוכית ומכסים במתנול. אטמו את המכסה עם סרט איטום והתרחצו במשך 10 דקות.
לאחר ההסתלקות, רוקנו את המתנול לתוך בקבוק אחסון זכוכית. חזור על שלב זה עם אצטון. יש לשטוף את הכיסוי שלוש פעמים במים מזוקקים כפולים בצנצנת קופלין.
מסננים את המים ממחליקי הכיסוי ומייבשים אותם על ידי נפנוף דרך הלהבה של מבער בונזן. מניחים את החלקות הכיסוי בצנצנת קופלין יבשה. לאחר מכן הוסיפו תמיסת אמינו סילאן לצנצנת קופלין כדי לבצע סילאניזציה של אמינו החלקה.
מכסים ומורחים סרט איטום כדי להגן מפני אור. שוטפים את החלקות הכיסוי במתנול ומשליכים את התמיסה המשומשת. שוב, שטפו את הכיסוי מחליק שלוש פעמים במים מזוקקים כפולים למשך שתי דקות כל אחת.
יש לטשטש את עודפי הלחות ולייבש את האוויר לחלוטין למשך 10 דקות. לאחר מכן, לצייר מערך רשת עם עט מחסום הידרופובי. סמן מזהה על לוח הכיסוי כדי לזהות את הכיוון הנכון.
לאחר שהדיו מתייבש, מניחים את הכיסוי מחליק בתא לח. 153 מיליגרם של mPEG ו-3.9 מיליגרם של ביוטין-PEG ב-609 מיקרוליטרים של 10 מילימולאר נתרן ביקרבונט ומערבולת. צנטריפוגה ב 10, 000 x g מדקה אחת בטמפרטורת החדר כדי להסיר בועות.
החל 10 עד 15 מיקרוליטרים של פתרון זה לכל ריבוע כדי לכסות לחלוטין את המערך מבלי לעלות על גדותיו. אחסנו את הכיסוי מחליק לתוך תא הלחות בחושך למשך שלוש עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף את החלקות הכיסוי על ידי טבילתם במשך 10 שניות ברצף לתוך שלושה כוסות מלאות במים מזוקקים כפולים.
הסר את כל הלחות מהחלקות הכיסוי באמצעות גז חנקן. אחסנו את הכיסויים גב אל גב בצינור חרוטי 50 מיליליטר מלא בחנקן ואטמו עם סרט איטום. עוטפים את הצינור בסרט איטום ומניחים אותו על מינוס 20 מעלות צלזיוס.
הסר את המערכים הפונקציונליים של ביוטין-PEG מהמקפיא ושווי משקל אותם לטמפרטורת החדר. מניחים את החלקת הכיסוי כאשר המערך פונה כלפי מעלה לצלחת תרבית רקמה של 100 מילימטרים מרופדת בסרט איטום. דגירה של כל ריבוע של המערך עם 10 מיליגרם למיליליטר של נתרן בורוהידריד ב- PBS במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר.
לשטוף שלוש פעמים עם PBS. הדגירה הבאה עם 0.2 מיליגרם למיליליטר של NeutrAvidin ב- T50 במשך חמש דקות, ואחריה שטיפה שלוש פעמים עם T50 BSA. חזור על הדגירה עם שני מיקרוגרם למיליליטר של נוגדן ספציפי ל- POI ביוטינילי ב- T50 BSA במשך 10 דקות ולאחר מכן שטיפה.
ראשית, הפשרה מערבבת את הליזאט על ידי צנרת. דיללו מיקרוליטר אחד של הליזאט ל-100 מיקרוליטרים של T50 BSA PPI קר כקרח. דגירה של הליזאט על המערך למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטיפה.
הכן את הנוגדן האנטי-פוספוטירוזין המצומד AF647 בקור קרח T50 BSA PPI ודגירה על המערך למשך שעה אחת. להפקיד טיפת שמן על המטרה. הניחו את הננו-גריד על הבמה להדמיה.
באמצעות אור לבן המועבר, התמקדו בתבנית הרשת. רכשו סדרה של 20 תמונות של הרשת, ודאו שהפיקסלים אינם רוויים ושמרו את סדרת התמונות כ-fiducial. נטרלו את הננו-גריד כדי ליצור תבנית אוורירית, רכשו סדרה של 20 תמונות לכיול רווח ושמרו את התמונה כרווח.
לאחר מכן השג סדרה של 20 תמונות להסטת המצלמה על ידי חסימת כל האור למצלמה ושמיר את רקע התמונות. כדי להשיג תמונות פשוטות, ראשית, לנקות את מטרת השמן ולהפקיד שמן נוסף על המטרה. אבטחו את מערך החלקת הכיסוי על במת המיקרוסקופ.
קבל תמונות עבור כל דגימה, תחילה בערוץ האדום הרחוק, ואחריו פלואורופורים באורך גל נמוך יותר. בדקו את רמת המאגר כל 30 עד 45 דקות ומלאו את המלא לפי הצורך. באמצעות טכניקה זו, EGFR-GFP נלכד מתוך סך כל החלבון lysates.
הפלואורסצנציה האוטומטית של הדיו ההידרופובי שימשה כמדריך למציאת מישור המוקד של הדגימה. תמונות נתונים גולמיות נרכשו עם ערוצים ספקטרליים המופרדים על שבב המצלמה. שכבת-על של הערוצים הירוקים והאדומים-רחוקים נבחנה עוד יותר לצורך רכישת נתונים.
רישום הערוץ בוצע על תמונות שנרכשו מהננו-גריד. שכבה של תמונות פידוקיאליות הראתה רישום לא שלם. היישור נעשה על ידי החלת טרנספורמציה ממוצעת משוקללת מקומית על קואורדינטות הערוצים האדומות והירוקות הרחוקות, ששימשו לרישום נתוני SiMPull הבאים.
פולטים בודדים מעל ספירת הפוטונים ברקע מערוצי ה-GFP וה-AF647 הוכנסו לאגרוף, ולוקליזציה של גאוס בוצעה כדי לזהות את המיקומים. קולוקליזציה של EGFR-GFP ב-F647 נעשתה כדי לזהות קולטנים זרחניים. ואחוז הקולוקליזציה שימש כדי לקבוע את החלק של קולטנים זרחניים.
גילויי הרקע הופחתו כאשר זכוכית חרוטת פיראנה טופלה בנתרן בורוהידריד. קשירה חזקה של EGFR-GFP בליזאט נצפתה עם קשירה מינימלית לא ספציפית של PY99-AF647, מה שמראה שמירה על תפקוד פני השטח באמצעות טכניקה זו. SiMPull מספק מידע על זרחון חלבונים ויכול לענות על מגוון רחב של שאלות איתות עצמי.
זה יכול לשפר את ההבנה שלנו של איתות במצבים נורמליים ומחלות כאחד.
