פרוטוקול זה ידגים יישום ואופטימיזציה של מיקרוסקופיית SRS ממוקדת ספקטרלית וכיצד ניתן להשתמש בה ליישומי היסטולוגיה של ראמאן בזמן אמת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא המהירות שבה דגימות ניתן לעבד לאחר המכשור מיושר כראוי, שכן SRS אינו דורש עיבוד רקמות וצביעה. פרוטוקול זה חל על יישומי SRS אחרים, ולא רק מוגבל להיסטולוגיה.
יישומים כאלה כוללים מולקולות קטנות, תרופות, תאים ורקמות. התחל בהתקנת זוג עדשות אכרומטיות עבור קרן המשאבה כדי להגדיל את גודל קרן הלייזר פי שניים כנקודת התחלה. הניחו עדשת 100 ו-200 מילימטרים במרחק של כ-300 מילימטרים זה מזה.
לאחר מכן יישרו את קרן המשאבה דרך מרכז שתי העדשות. לאחר מכן הניחו מראה אחרי העדשה השנייה כדי לשלוח את הקורה לכיוון קיר במרחק של יותר ממטר אחד. עקבו אחר הקורה מהמראה אל הקיר באמצעות כרטיס IR ובדקו אם הקרן משתנה בגודלה.
רכז את הקרן אם הקרן משתנה בגודלה כפונקציה של מרחק. שלבו את שתי קרני הלייזר על ידי התקנת מראה דיכרואית עם מספר מראות היגוי להתאמה. מטב את החפיפה המרחבית של המשאבה ושל סטוקס על ידי ניטור אלומות אחרי המראה הדיכרואית בשתי עמדות שונות במרחק של כמטר אחד זו מזו.
כוונון איטרטיבי של מראת ההיגוי ואחריה המראה הדיכרואית כדי ליישר את קרן סטוקס עם קרן המשאבה. ודא שהקורות המשולבות נשלחות למרכז מראות הסריקה של מיקרוסקופ סריקת הלייזר על ידי התאמת זוג מראות היגוי כאשר מראות הסריקה נמצאות במצב החונה. לאחר המעבה, השתמש בזוג עדשות נוסף עם אורכי מוקד של 100 מילימטרים ו -30 מילימטרים, בהתאמה, כדי להעביר את הקרן המועברת על הפוטודיודה, ולהבטיח ששתי האלומות מוכלות בתוך הפוטודיודה.
לאחר מכן התקן שני מסנני מעבר נמוכים כדי לחסום את קרן סטוקס המאופננת. הניחו דוגם קרן בנתיב הקרן של סטוקס כדי לאסוף 10% מהקרן ושלחו אותה לפוטודיודה מהירה כדי לזהות את רכבת הדופק של 80 מגה-הרץ. קחו את אחת היציאות של מאגר המניפה וסננו אותה עם מסנן פסים כדי להשיג גל סינוסואידלי של 20 מגה-הרץ.
לאחר מכן השתמש במנחת RF כדי להתאים את שיא היציאה למתח שיא לכ-500 מיליבולטים. שלח את הפלט המתקבל למשנה פאזה, המאפשר התאמה עדינה של פאזת ה- RF עם מקור מתח. שלח פלט זה למגבר כוח RF וחבר את הפלט של המגבר ל- EOM.
לאחר הסרת החסימה של קרן סטוקס, מטב את עומק המודולציה של ה- EOM הראשון על ידי הצבת פוטודיודה בנתיב הקרן. התאם את מתח ה- EOM ואת לוחית הגלים הרבעונית עד שעומק המודולציה ייראה משביע רצון. הניחו פוטודיודה אחרי המראה הדיכרואית כדי לזהות את קרן הלייזר.
חסום תחילה את קרן סטוקס, ואז התקרב לאחת מפסגות פולס המשאבה באוסצילוסקופ. מקם סמן אנכי כדי לסמן את המיקום הזמני של שיא זה עם האוסצילוסקופ. עכשיו לחסום את קרן המשאבה, ולבטל את החסימה של קרן סטוקס.
תרגם את שלב ההשהיה כך שיתאים באופן זמני את מיקומי השיא באוסצילוסקופ למיקום המסומן בשלב הקודם. על ידי חישוב מרחק ההשהיה הנדרש כדי להתאים את שתי הקורות ולאחר מכן הארכת נתיב הקרן של הקרן המהירה יותר או קיצור נתיב הקרן של הקרן האיטית יותר. לאחר מכן הכינו דגימת שקופיות של מיקרוסקופ עם DMSO וסרט דו-צדדי כמרווח כדי להחזיק את הדגימה בין השקופית לכיסוי.
הניחו את הדגימה על המיקרוסקופ כשצד הכיסוי פונה אל מטרת המיקרוסקופ והתבוננו בדגימה מתוך היצירה I תחת תאורת שדה בהיר. מצא את מוקד הדגימה הן בשכבה העליונה והן בשכבה התחתונה של בועות האוויר בממשק סרט הזכוכית, ולאחר מכן הזז את המיקוד להיות בין שתי השכבות של הקלטת. לאחר מכן הגדר את תפוקת הקרן הניתנת לכוונון ל-798 ננומטר.
בהתבסס על התפוקה האופטית של המעבה, התאם את ההספק האופטי כך שיהיה כ-40 מילי-וואט כל אחד עבור המשאבה ואת אלומות סטוקס במוקד המטרה. לאחר מכן פתח את תמונת הסריקה ב- MATLAB ולחץ על הכפתור שכותרתו מיקוד כדי להתחיל בסריקה. התאם את מראת ההיגוי לפני סורק ה-galvo כדי למרכז את אות ה-DC בצג הערוץ הראשון.
הזז את שלב ההשהיה הממונע והתבונן מקרוב בפלט הנעילה המוצג בתצוגת ערוץ שתיים. לבסוף התאם את השהיית הזמן כדי למקסם את עוצמת האות AC. התאם את המראה הדיכרואית למרכז אות ה- SRS בערוץ AC.
לאחר מכן התאם את הפאזה של מגבר הנעילה כדי למקסם את האות. לאחר הרכבת הדגימה החלקה על המיקרוסקופ והתאמת העוצמה של שתי האלומות לכ-40 מילי-וואט כל אחת במוקד הדגימה כפי שהודגם קודם לכן. פתח את תמונת הסריקה מ- MATLAB.
לאחר מכן מצא את אות ה- SRS המקסימלי על ידי סריקה דרך שלב ההשהיה המתאים לשיא Raman ההופכי של 2, 913 סנטימטרים הפוכים של DMSO. רכשו תמונת SRS המתאימה לשיא ראמאן ההופכי של 2, 913 ס"מ, של DMSO. פתחו את התמונה ב-ImageJ ובחרו אזור קטן במרכז המסגרת.
השתמש בפונקציית המדידה כדי לחשב את הממוצע וסטיית התקן של ערכים באזור שנבחר. לכיול גישת תדרים, שמור סריקה היפרספקטרלית עם טווח שלבי ההשהיה המכסה את פסגות 2, 913 ו- 2, 994 סנטימטרים הפוכים של Raman של DMSO. לאחר מכן שמור את מיקומי הבמה המתאימים לערכת הנתונים ההיפר-ספקטרלית.
בצע רגרסיה ליניארית לתנוחות הבמה ותזוזות ראמאן ב-2, 913 ו-2, 994 סנטימטרים הפוכים. באמצעות משוואת הרגרסיה הליניארית, המר את מיקומי ההשהיה לתדרי הראמן המתאימים. לכיול הרזולוציה הספקטרלית, הערך את מיקום הבמה בהתבסס על המיקום הקודם עם אורך הנתיב האופטי המוגבר עקב החדרת מוטות.
יישור מחדש את החפיפה המרחבית של הקורות בגלל הסטייה הקלה של הקורה כאשר מוסיפים מוטות זכוכית. התקינו מפצל קרן מקטב, צלחת רבע גל ו-EOM שני לנתיב קרן הטבילה לאחר ה-EOM הראשון. נתק את כניסת האות ל- EOM השני, ולאחר מכן חבר את קלט האות ל- EOM הראשון והפעל אותו.
כוונן את קרן סטוקס ב-20 מגה-הרץ על ידי שליחת הקרן דרך ה-EOM הראשון. התאם את ההטיה והמיקום של ה- EOM הראשון כדי להבטיח שהקרן ממורכזת דרך גביש EOM. הכינו דגימת שקופית טישו עם סרט דו-צדדי, החלקת מיקרוסקופ וזכוכית כיסוי.
הניחו את הדגימה על המיקרוסקופ כשצד הכיסוי פונה אל מטרת המיקרוסקופ. להדמיית SRS במצב אפי, התקינו לוחית חצי גל לפני שהקרן נכנסת למיקרוסקופ כדי לשנות את הקיטוב של הקרן הנכנסת למיקרוסקופ. מקם מפצל קרן מקטב מעל המטרה כדי לאפשר לקרן המוחזרת האחורית המדה-קוטבית להגיע לגלאי.
לאחר מכן, השתמש בעדשת 75 מילימטר achromate ועדשה אספרית של 30 מילימטר כדי להעביר את הפוטונים המפוזרים מאחור מהפתח האחורי של המטרה לגלאי הצילום. הרכיבו את הגלאי כדי לאסוף את האור המפוזר האחורי המכוון על ידי מפצל האלומות המקטב. לאחר מכן התקן מסנן כדי לחסום את הקרן המאופננת מלהיכנס לגלאי.
שינוי אורכי המוט משפיע על הרזולוציה הספקטרלית. כאשר לא נעשה שימוש במוטות ציוץ זכוכית, שתי פסגות הראמן מ- DMSO אינן נפתרות כלל. עלייה במספר מוטות ציוץ הזכוכית מתחילה לפתור את שתי הפסגות בנקודה משביעת רצון.
ציוץ תואם פותר את שתי הפסגות וניתן להשתמש בו כדי לכייל את מיקומי הבמה לתדר. שתי רכבות דופק מושהות בזמן של קיטוב אורתוגונלי המשמשות לצילום ספקטרום DMSO מראות את עיכוב הזמן בין עירורי SRS עם עומק אפנון מקובל והפרדה זמנית. לעומת זאת, שינוי פאזה לקוי של SRS בשני צבעים, יוצר פסגות הפוכות או שליליות.
הדמיית SRS בשני צבעים בזמן אמת ב-2, 850 ו-2, 930 סנטימטרים הפוכים של רקמת מוח של עכבר ex vivo מוצגים כאן. תמונות השומנים והחלבון הגולמיות היו מקודדות בצבע כדי לייצר תמונה אחת המתארת את תרומת השומנים והחלבון. צביעה מחדש של המטוקסילין ואאוזין כוזבים, בוצעו גם כדי לחקות את ההמטוקסילין ואת צביעת האאוזין ליישומים פתולוגיים.
חפיפה טמפורלית מרחבית ואופטימיזציה של רזולוציה מרחבית הם השלבים החשובים ביותר לגישת המיקוד המרחבי של SRS. שיטה זו ישימה בדרך כלל לניסויים אחרים במיקרוסקופיה של בדיקות משאבה כגון מיקרוסקופיית ספיגה חולפת. השיטה מאפשרת גם הדמיה של מולקולות שאינן פלואורסצנטיות בתאים וברקמות.
השיטה המוצגת כאן מאיצה את זמן רכישת התמונה לתרגום עתידי של היסטולוגיה של ראמאן מגורה במרפאה.
