השיטה שנדגים היום מספקת פתרון בתפוקה גבוהה להערכת המרת sero של נוגדנים הקשורים לזיהומים ב-COVID-19 או לחיסון לניתוחים שגרתיים. באופן מעניין, גישה זו מאפשרת לנו להעריך אפיטופים מרובים על אותו אנאליט. יש לכך יישומים רבים במדעי הביולוגיה, כולל מחקרי איתות תאי וניטור תגובות חיסוניות.
מי שידגים את הטכניקה הזו עבורכם היום יהיה ד"ר עימאד טארהוני, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. כדי להתחיל, בחר שלושה בקבוקונים שונים של המיקרו-ספירות המגנטיות עם אזורי חרוזים ייחודיים ותעד את מזהה החרוזים ומידע רב עבור כל בקבוקון בשימוש. לאחר מכן, מערבולת את מלאי המיקרוספרה שנבחרה במשך 60 שניות וסוניק במשך חמש דקות.
מעבירים 1.0 כפול 10 לששת החרוזים לצינור מיקרו-צנטריפוג נמוך חלבון בעל 1.5 מיליליטר ומכניסים את הצינור למפריד מגנטי. כדי לאפשר את ההפרדה למשך 60 שניות. כאשר הצינור עדיין במפריד המגנטי, הסר בזהירות את ה- supernatant מבלי להפריע לכדור החרוז.
הסר את הצינור מהמפריד המגנטי, ולאחר מכן החייא את החרוזים עם 100 מיקרוליטרים של מים ומערבולת ברמת HPLC למשך 30 שניות. שוב, מניחים את הצינור בחזרה לתוך המפריד המגנטי למשך 60 שניות ולאחר מכן מסירים את הסופרנטנט. חזור על פרוטוקול הכביסה פעמיים.
לאחר הכביסה האחרונה, הסר את הצינור מהמפריד המגנטי והחזיר את המיקרו-ספירות השטופות ב-90 מיקרוליטרים של מאגר הפעלה, pH 6.2, על ידי מערבולת למשך 30 שניות. לאחר מכן, טיפול רציף במיקרו-ספירות עם 10 מיקרוליטרים של 50 מיליגרם למיליליטר אנהידרוקסי-סולפוסוצ'ינאמיד ו-10 מיקרוליטרים של 50 מיליגרם לתמיסת EDC למיליליטר על ידי מערבולת למשך 10 שניות. מאוחר יותר, דגירה של המיקרו-כדורים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם מערבולת עדינה כל 10 דקות.
לאחר הדגירה, לשטוף את המיקרוספרות פעמיים עם MES 50 מילימולרי או חיץ צימוד, pH 5.0, כפי שתואר קודם לכן. חזור על הכביסה פעמיים. לאחר הסיום, הסר את הצינור מהמפריד המגנטי והחזיר את החרוזים עם 100 מיקרוליטרים של חיץ צימוד על ידי מערבולת למשך 30 שניות, ולאחר מכן מיד על ידי הוספת כמות החלבון הרצויה לצינור.
הביאו את הנפח הכולל ל-150 מיקרוליטרים עם מאגר צימוד וערבבו את התגובה על ידי מערבולת למשך 30 שניות. לאחר מכן, דגירה של הצינור במשך שעתיים על ידי סיבוב בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שטפו את המיקרוספרות פעמיים עם מאגר מרווה PBS והחזירו את המיקרוספרות השטופות ב-100 מיקרוליטרים של מאגר מרווה המכילים 0.05% נתרן אזיד על ידי מערבולת למשך 30 שניות.
ספרו את מספר המיקרו-ספירות שהתאוששו באמצעות מונה תאים אוטומטי ותעדו את ריכוז החרוזים שנצפה. לצורך ביצוע הבדיקה, בצעו החייאה של המיקרו-ספירות המצומדות על ידי מערבולת למשך 30 שניות והצליל למשך 60 עד 90 שניות. לאחר מכן, הסר את הכמות הנדרשת של כל קולואיד חרוז מהצינור המתאים ושלב את קולואידי החרוזים בצינור מיקרו-צנטריפוג חדש של 1.5 מיליליטר.
לאחר מכן, הכנס את הצינור למפריד מגנטי ואפשר הפרדה למשך 60 שניות. כאשר הצינור עדיין במפריד המגנטי, הסר את ה- supernatant מבלי להפריע לכדור החרוז. לאחר הסרת החרוזים מהמפריד, יש להחיות את החרוזים ב-100 מיקרוליטרים של מאגר בדיקה.
מערבולת במשך 30 שניות לפני שמניחים את הצינור במפריד מגנטי למשך 60 שניות כדי להפריד בין החרוזים. חזור על הכביסה פעמיים. לאחר מכן, התאם את הריכוז של תערובת המיקרוספרה העובדת בעלת שלושת המלפלים על ידי הוספת נפח מתאים של מאגר בדיקה כדי ליצור ריכוז סופי של 100 מיקרוספרה לכל מיקרו-לייטר אחד עבור כל מטרה.
Aliquot 25 מיקרוליטרים של תערובת המיקרוספרה לתוך כל באר של צלחת 96 באר. דיללו דגימות פלזמה או סרום פי 500 במאגר בדיקה והכינו דגימות סטנדרטיות בהתאם לטיטרציה הרצויה. הוסף 25 מיקרוליטרים של מאגר הבדיקה כדגימה הריקה והוסף כל אחת מהדגימות המדוללות או התקן לכל באר ייעודית של לוח דגימה בן 96 בארות.
בסיום, מכסים את הצלחת בחותם אלומיניום או בנייר כסף כדי לדגום במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על שייקר צלחת שנקבע ל-700 סיבובים לדקה. הכינו תמיסה של נוגדנים נגד זיהוי נגד בני אדם או תמיסות נוגדנים משניות בארבעה מיקרוגרם למיקרוליטר עם מאגר בדיקה כמתואר בכתב היד. מניחים את הצלחת על מפריד מגנטי כדי לשטוף במהירות ואז הופכים בכוח את הצלחת מעל מיכל ביוהאזרד כדי להסיר את הנוזל מהבארות.
כשהצלחת עדיין הפוכה, הקש בכוח על הצלחת על ערימת נייר עבה. לאחר מכן, לשטוף כל באר עם 100 microliters של מאגר בדיקה ולהסיר את הנוזל על ידי היפוך כוחני על מיכל biohazard. חזור על הכביסה פעמיים.
לאחר הכביסה האחרונה, השליכו את כל ערימות הנייר המשומשות לתוך מיכל ביו-האזרד. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של תמיסת עבודה משנית של נוגדנים לכל באר של צלחת של 96 קידוחים וכיסו את הצלחת בנייר אלומיניום כדי לדגור על שייקר צלחת ב-700 סיבובים בדקה. לאחר 30 דקות של דגירה, שטפו את בארות הצלחת פעמיים עם חיץ בדיקה כפי שהודגם קודם לכן.
לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חיץ בדיקה לכל באר של צלחת 96 הבארות. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ומדגרים במשך חמש דקות על שייקר צלחת בטמפרטורת החדר. נתח דגימה של 60 מיקרוליטר באמצעות מנתח המכשירים על פי מדריך המערכת.
לצורך אופטימיזציה של זמן הדגירה של לכידת הדגימה, יש לדגום את הלוחות למשך 30, 60 ו-120 דקות. לאחר הדגירה, לנתח 60 microliters של תערובת הבדיקה על המנתח. עקומה סטנדרטית בת שבע נקודות המבוססת על סדרת דילול סדרתי של 1:5 הוערכה עבור הספייק S1, נוגדני הממברנה והנוקליאוקפסיד.
בדיקת הדיוק תוך-בדיקה בוצעה על הלוח כדי להעריך את דיוק הבדיקה שחושב כמקדם אחוז של שונות, סטיית תקן וממוצע. למען הדיוק בין המבחנים, הוכנו שלוש קבוצות נפרדות של ערכות החרוזים לכל בדיקה. חושבו משתני הדיוק של הבדיקה עם תקן ודגימות הפלזמה האנושיות.
ערכי העוצמה הפלואורסצנטית החציונית הממוצעת ב-120 דקות של הדגירה היו אופטימליים עבור טיטר IgG עבור הספייק S1, הממברנה והנוגדנים הנוקליאוקפסידים, מה שמצביע על קינטיקה של נוגדנים ראשוניים מהירים. אופטימיזציות של ריכוז נוגדנים משניים בביצועי תעלות כפולות הדגימו מגוון רחב של אותות במדידה ליניארית לכל הריכוזים. האותות הנצפים מדגירות זמן שונות של הנוגדנים המשניים והפרטים על שינויי האותות עבור כל זמני הדגירה מוצגים כאן.
בהערכות הספציפיות לבדיקות דו-ערוציות, נצפה זיהום זניח של אותות צולבים בין הריק לערוץ הכתב היחיד. בהמחשה של אירועי המרת סרו בעקבות חיסון COVID 19, ערכי ה-IgA וה-IgM הנצפים של הזינוק שנצפו היו נמוכים בערך פי 40 מהטיטרים האיזוטיפיים של IgG. לשיטה זו יש השלכות חשובות על ניטור התגובה לחיסונים אצל אנשים מדוכאי חיסון.
זה יאפשר לנו לקבוע אם החולים האלה באמת מקבלים הגנה על ידי החיסונים האלה.
