使用多分析物免疫珠测定法对Covid-19进行血清转换的动态监测

我们今天将要演示的方法提供了一种高通量解决方案，用于评估与COVID-19感染或常规分析疫苗接种相关的抗体的血清转换。有趣的是，这种方法使我们能够评估同一分析物上的多个表位。这在生物科学中有许多应用，包括细胞信号研究和监测免疫反应。

今天为你们展示这种技术的将是Imad Tarhoni博士，他是我实验室的博士后研究员。首先，选择三个具有不同磁珠区域的磁性微球小瓶，并记录每个所用小瓶的磁珠ID和批次信息。然后，将选定的微球储备涡旋60秒，超声处理5分钟。

将1.0倍10倍转移到6个珠子中，放入1.5毫升低蛋白结合微量离心管中，然后将管插入磁选机中。允许分离 60 秒。当管子仍在磁选机中时，小心地除去上清液而不干扰珠粒。

从磁选机上取下管子，然后用100微升HPLC级水和涡旋30秒重新悬浮磁珠。再次，将管放回磁选机中60秒，然后取出上清液。重复洗涤方案两次。

最后一次洗涤后，从磁选机中取出管子，并将洗涤的微球重悬于90微升活化缓冲液中，pH 6.2，涡旋30秒。接下来，依次用10微升50毫克/毫升的羟基磺基琥珀酰胺和10微升每毫升50毫克的EDC溶液通过涡旋处理微球10秒。之后，将微球在室温下孵育20分钟，每10分钟进行一次温和的涡旋。

孵育后，如前所述，用50毫摩尔MES或偶联缓冲液pH 5.0洗涤微球两次。重复洗涤两次。完成后，从磁选机中取出管子，并通过涡旋将珠子与100微升偶联缓冲液重悬30秒，然后立即向管中加入所需量的蛋白质。

用偶联缓冲液将总体积达到150微升，并通过涡旋混合反应30秒。然后，在室温下旋转将试管孵育两小时。孵育后，用PBS淬火缓冲液洗涤微球两次，并将洗涤的微球重悬于100微升含有0.05%叠氮化钠的淬火缓冲液中，涡旋30秒。

使用自动细胞计数器计算回收微球的数量，并记录观察到的微球浓度。为了获得测定性能，通过涡旋重悬耦合的微球30秒，超声处理60至90秒。然后，从相应的管中取出所需量的每个珠胶体，并将珠胶体组合在新的1.5毫升微量离心管中。

接下来，将管子插入磁选机中，并分离60秒。当管子仍在磁选机中时，在不干扰珠粒的情况下除去上清液。从分离器中取出磁珠后，将磁珠重悬于100微升测定缓冲液中。

涡旋30秒，然后将管子放入磁选机中60秒以分离珠子。重复洗涤两次。接下来，通过添加适当体积的测定缓冲液来调节三重工作微球混合物的浓度，以为每个靶标产生每微升100微球的最终浓度。

将25微升的微球混合物等分试样放入96孔板的每个孔中。在测定缓冲液中将血浆或血清标本稀释500倍，并根据所需的滴定制备标准样品。加入25微升测定缓冲液作为空白样品，并将每个稀释的样品或标准品加入96孔样品板的每个指定孔中。

完成后，用铝封或铝箔盖住板，在室温下在设置为每分钟700转的板振荡器上孵育一小时。如手稿中所述，用测定缓冲液以每微升四微克制备抗人检测抗体或二抗溶液的溶液。将板放在磁选机上快速洗涤，然后用力将板倒置在生物危害容器上以从孔中除去液体。

在盘子仍然倒置的情况下，用力将盘子拍打在厚厚的纸上。然后，用100微升测定缓冲液洗涤每个孔，并通过在生物危害容器上强力倒置除去液体。重复洗涤两次。

最后一次洗涤后，将所有用过的纸丢弃到生物危害容器中。接下来，向96孔板的每个孔中加入25微升的二抗工作溶液，并用铝箔覆盖板，以每分钟700旋转在板振荡器上孵育。孵育30分钟后，如前所述，用测定缓冲液洗涤板的孔两次。

然后，向96孔板的每个孔中加入100微升测定缓冲液。用铝箔盖住板，并在室温下在板振荡器上孵育五分钟。根据系统手册，通过仪器分析仪分析 60 微升样品。

为了优化样品捕获孵育时间，将板孵育30，60和120分钟。孵育后，在分析仪上分析60微升的测定混合物。基于1:5连续稀释系列的7点标准曲线评估了尖峰S1，膜抗体和核衣壳。

在板上进行测定内精度测试，以评估以变异系数，标准偏差和平均值计算的测定精度。为了测定间的精确性，为每个测定制备了三个不同批次的磁珠组。用标准品和人血浆样品计算测定的精确变量。

孵育120分钟时的平均中位荧光强度值对于刺突S1，膜和核衣壳抗体的IgG滴度是最佳值，表明一抗结合动力学快。双通道性能的二抗浓度优化表明，在所有浓度的线性测量中，信号范围很广。这里显示了来自二抗不同时间孵育的观察到的信号以及所有孵育时间的信号变化的详细信息。

在双通道测定的特异性评估中，在空白通道和单报告通道之间观察到可忽略不计的交叉信号污染。在COVID 19疫苗接种后血清转换事件的图示中，观察到的峰值S1 IgA和IgM值比IgG同种型滴度低约40倍。该方法对于监测免疫功能低下个体对疫苗的反应具有重要意义。

这将使我们能够确定这些患者是否真的受到这些疫苗接种的保护。