האיכות של השעיה מוכנה של תא יחיד חיונית להשגת תוצאות באיכות גבוהה ואמינה עבור כל מתודולוגיית omics של תא יחיד. והפרוטוקול הזה יראה לכם איך לבודד תאים במהירות, בעדינות ובחזקה אפילו מרקמות מאתגרות מאוד. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא עיבוד רקמות יעיל המאפשר ניתוק רקמות ובידוד של תאים ממספר רב של דגימות בזמן קצר עם איכות מושלמת.
למרות ששיטה זו פותחה עבור עכבר ושיניים אנושיות, ניתן להחיל אותה גם על רקמות אחרות עשירות במטריצה חוץ-תאית, כולל סחוס, עצם או רקמת חיבור צפופה. ההליך של בידוד פעימות שיניים משיני אדם ובמיוחד עכבר הוא מאתגר באופן ידני. אנו ממליצים לכולם לבדוק את זה לפני שהניסויים האמיתיים מתחילים.
כדי להתחיל, להחזיק את העכבר המתחסד מאחורי ראשו מסתכל על ההיבט הגחוני של ראשו, כך הזנב מצביע משם. באמצעות המספריים הקטנים והחדים, הסר במהירות את העור מהלסת התחתונה כדי לחשוף את הקשת הלסת התחתונה, את הרקמה הרכה בין כל מחצית הלסת התחתונה ושרירי הפנים הסמוכים. לביצוע חתך עמוק מכל צד של הלסת התחתונה, תחילה לחתוך דרך מעסה לאורך הצד buccal של הלסת התחתונה עד המפרק temporomandibular ולאחר מכן לחתוך לאורך החלק הפנימי של כל חצי הלסת התחתונה דרך הבסיס של חלל הפה.
חותכים את כל השרירים והרצועות לאורך הלסת התחתונה עד למפרק הטמפורומנדיבולרי הן מבחוץ והן מבפנים של חלל הפה. תפוס את הלסתן באמצעות פינצטה קצה כפופה ולהסיר אותו. ואז עם המספריים, לחתוך דרך סימפיזה הלסת התחתונה לפצל את הלסת התחתונה ניתח לשני חצאים.
השתמש במחוב מוך נמוך תעשייתי כדי לשפשף את הרקמה הרכה הנותרת מכל חצי מהלסתן. לאחר שני חלקי הלסת התחתונה מנוקים, מניחים אותם לתוך צלחת פטרי מוכנה מראש עם HBSS קר כקרח. עבור ניתוח של חתכים הלסת התחתונה, להסיר את הרכס המכתשי עם כל שלוש הטוחנות לרוחב לפצח את הקשת הלסת התחתונה במקום המתאים למיקום בין הטוחנת הראשונה והשנייה.
בזהירות למשוך את השן החותך מתוך שאר שקע השיניים. במידת הצורך, להסיר את שברי העצם הנותרים המחוברים לשן החותכת עם פינצטה ואזמל. מניחים את החותכים הניתחו לתוך HBSS קר כקרח טרי.
לאחר ניתוח רקמת העניין, מניחים את הרקמה הרכה המנותחת בטיפת HBSS קרה כקרח טרייה באמצע צלחת פטרי באורך 10 ס"מ שנשמרה על קרח. באמצעות להב אזמל מספר 10 עגול בצורת, לחתוך את הרקמה לחתיכות הקטנות ביותר האפשריות. לאחר צבירה מחדש של חתיכות הרקמה באמצע הטיפה, לחתוך שוב ושוב את אגרגטים הרקמה עם אותו להב אזמל ולחזור על תהליך זה עד החומר הוא טחון מספיק.
מעבירים את חתיכות הרקמה הגרוסה באמצעות טיפ פיפטה מיליליטר אחד לתערובת עיכול שהוכנה בעבר. לאחר מכן מניחים את הצינור בזווית של 60 מעלות ומגדירים את המהירות ל-150 עד 200 סל"ד כדי להבטיח תנועות מתלים קבועות בתוך הצינור ודגרה במשך 15 עד 20 דקות. לאחר כל שלוש עד ארבע דקות במהלך הדגירה, תרגיז במרץ את המתלה באמצעות קצה פיפטה של מיליליטר אחד כדי לפורר את כל הגושים.
בסוף הדגירה, לאחר titrating השעיית התא בפעם האחרונה, לאט להוסיף פתרון לשטוף קר קרח לנפח הסופי של 12 מיליליטר. צנטריפוגה השעיית התא ב 300 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולאחר מכן להסיר בזהירות את supernatant עם פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר. Resuspend הכדור בתמיסת לשטוף כדי להשיג את הריכוז הסופי של 700 עד 1, 200 תאים לכל microliter.
להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 50 micrometer כדי להסיר את הגושים הנותרים או חתיכות של רקמה מסוידת ולשמור את הצינור על קרח עד עיבוד נוסף. ואז למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, לטעון את התאים לתוך צינור מוכן. טען את הצינור לתוך ממיין התאים והגדיר אסטרטגיית גטינג קפדנית להסרת פסולת תאים, כפילים ותאים מתים כמתואר בכתב היד של הטקסט.
ראשית, כתמי נוגדני CD45 וניתוח FACS שלאחר מכן שימשו לבירור מספר תאי החיסון בהשעיה הסופית של תא בודד. כשיטה משלימה, נותחו המספר הכולל של תאי מערכת החיסון החיוביים CD45 בנתוני ריצוף הרנ"א החד-תאיים. באמצעות FACS זוהו 14.44%CD45 תאים חיוביים.
ניתוח נתוני ריצוף RNA של תא יחיד הראה כי 10.9% מהתאים המביעים CD45 וירידה בתאים בנתוני ריצוף RNA של תא בודד עלולה להיגרם על-ידי סף נוסף במהלך ניתוח רצף. הדברים העיקריים הם להיות מהיר ולשמור על רקמה זו או תאים על קרח בכל הזדמנות אפשרית. מספר התאים המבודדים יכול להיות נמוך מאוד במיוחד במהלך בידוד שן-עכבר.
הימנע מאובדן תאים. קיצור הזמן של בידוד חד-תאי חשוב מאוד להצלחת כל הניסויים בתאים בודדים. ושיטה ספציפית זו באמת אפשרה להפחית את הזמן הזה ולסלול את הדרך לסוג תאי שיניים באיכות גבוהה עבור מערכות עכברים ואנושיים.
