בסרטון זה נראה כיצד לכמת את התמרת AAV ב רשתית העכבר באמצעות שיטת PCR טיפה דיגיטלית, שהיא רגישה ביותר ועושה כימות מוחלט של ה- DNA היעד. פיתחנו שיטה זו בעיקר עבור מבנים AVV גדולים שאינו מאפשר לנו להשתמש בגן עיתונאי כמו מבנים מבוססי CRISPR. באמצעות שיטה זו, אנו יכולים פשוט לכמת את קצב התמרה של AAVs ב רשתית.
שיטה זו מסתמכת על רגישות וכימות מוחלט של ה-PCR של טיפה דיגיטלית ומפיקה תוצאות ישירות קדימה. בסרטון זה נראה כיצד לכמת את התמרת AAV ב רשתית העכבר באמצעות שיטת PCR טיפה דיגיטלית, שהיא רגישה ביותר ועושה כימות מוחלט של ה- DNA היעד. פיתחנו שיטה זו בעיקר עבור מבנים גדולים באזור שאינו מאפשר לנו להשתמש בגן עיתונאי כמו מבנים מבוססי CRISPR.
באמצעות שיטה זו, אנו יכולים פשוט לכמת את קצב התמרה של AAVs ב רשתית. שיטה זו מסתמכת על רגישות וכימות מוחלט של שתי ה-PCR טיפה והניבה תוצאות ישר קדימה. בגלל היעילות של מתודולוגיית ה-PCR של טיפה דיגיטלית, מספר מעבדות כבר עוברות מ-PCR כמותי בזמן אמת לטיטרינג טיפה דיגיטלי PCR או AAV.
שיטה זו יכולה גם לספק בסיס לכימות DNA מיטוכונדריאלי ב רשתית, כמו גם לבדוק את היעילות של תיקון המוטציה מבוסס CRISPR לטיפול גנטי ב רשתית העכבר. הכן תערובת טרנספקטו עם פלסמיד עוזר AAV, פלסמיד קפסיד AAV, וקטור AAV, ופתרון PI בחמישה מיליליטרים ביקוש. מוסיפים את תערובת הטרנס-טריליטר שהוכנה לתקשורת התרבותית.
תאים מהודבקים מדגירה ב-37 מעלות צלזיוס. לאסוף את המדיה ב 48 עד 60 שעות לאחר transfection. לעכל את התקשורת עם DNAs בריכוז סופי של 250 יחידות למיליליטר במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס וצנטריפוגה זה ב 4, 000 גרם ארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
הרטיבו מראש את קרום התאית המחודשת עם PBS. סנן את המדיה עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר לתוך קרום התאית המחודשת הרטובה מראש עבור 100 קילו דלטון. צנטריפוגה קרום תאית מחודשת ב 4, 000 G ארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולהשליך את התקשורת.
לשטוף צנטריפוגות קרום תאית מחודשת עם PBS המכיל 0.001%F68 פלורוני שלוש פעמים ב 4000 G ארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאסוף AAVs מרוכז מהחלק העליון של קרום תאית מחודשת להקצות לשימוש נוסף. כאן הראינו כיצד ליצור ייצור AAV בקנה מידה קטן יותר.
לאחר בדיקת פרוטוקול זה, אתה אמור להיות מסוגל לעשות AVVs כי הוא מספיק כדי לראות את הביטוי הכתב ברשתית. באפשרותך גם לעקוב אחר הפרוטוקול עבור PCR דיגיטלי כדי שתוכל ליצור AAVs של ייצור. החל טיפה אחת של 0.5%טרופיקמיד ו 2.5%פנילפרין הידרוכלוריד המכיל טיפת עיניים לפני הרדמה כדי להרחיב את האישונים.
יש להכשיר עכברים עם איזופלוראן ולאמת את הרפלקסים. יש למרוח 0.3%טוברמיצין ו-0.1%dexamethasone סטרילי תמיסה עיניים טיפה לכל עין לפני הליך ההזרקה. השתמש וו כירורגי כדי לייצב את העפעף העליון.
לסגת מעט לאחור כדי לחשוף את החלק הגבי של העין. תדביק את הקרס ללהקה כדי להחזיק בעמדה. הסר את הלחמית עם המספריים המעוקלים-קשתית כדי לחשוף את הסקלרה של העין.
השתמש מזרק אינסולין 30G טרי וסטרילי כדי לנקב את הסקלרה. הכנס את המחט של מזרק מיקרו דרך אותו ניקור באמצעות מניפולטור מיקרו. מניחים את קצה המחט מאחורי העדשה באמצע העין.
הזריקו מיקרו ליטר אחד של תמיסה AAV לאט לתוך הזע של העין. השאר את המחט במקום במשך דקה אחת לאט למשוך את המחט. יש למרוח טיפול ג'ל אקטואלי אנטי דלקתי ואנטי בקטריאלי המכיל 0.3% טוברמיצין ו-0.1%דקסמתזון על העיניים.
החל ירידה אחת 0.5% טרופיקמיד. ו 2.5% פנילפרין הידרוכלוריד המכיל טיפת עיניים לפני הרדמה כדי להרחיב את האישונים. החל קרבמיד שני מיליגרם לג'ל אקטואלי גרם על פני השטח של העיניים.
התאם את מעמד העכבר לפי הצורך כדי למרכז את עין העכבר. בצע דימות פונדוס ופלואורסצנטיות בשתי העיניים כדי לעקוב אחר ביטוי TdTomato שבוע ושבועיים לאחר הזרקה תוך-ויטריאלית. המתת חסד בעלי החיים באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני לפני ההליך.
הסט את כדור העין קדימה בעזרת מלקחיים מפצלים 13.5 ס"מ. הסר את העדשה יחד עם הזגוג שנותר. חותכים את החיבור של גלגל העין לעצב הראייה עם מלקחיים מעוקלים מדויקים ולסחוט בעדינות רשתית עם אותם מלקחיים מעוקלים.
לבודד DNA גנומי עם ערכת DNA גנומי רקמות ממוסחרת K לעכל סרט מבוסס סרט. לעכל רשתית ב 55 מעלות צלזיוס 200 גרם במשך 30 דקות עם רשתית K.Lyse פרוטאינאז לחלוטין ולעקוב אחר sprotocol של היצרן. בפרוטוקולים אלה, הראינו הדמיית פלורס הזרקה תוך-ויטמינית, כמו גם בידוד רשתית ודנ"א גנומי.
אלה הם הליכים קריטיים מאוד עבור רשתית, ועל ידי ביצוע פרוטוקול זה, אתה אמור להיות מסוגל להזריק את AAVs המיוצר ולעקוב אחר פרופיל הביטוי שלהם. ומצקת את יעילות התמרה על ידי כימות הגנומים של AAV בדנ"א גנומי ברשתית. כאן, אתה יכול לראות את היישום הבסיסי של PCR טיפה דיגיטלית, שבו אתה יכול לעשות כימות מוחלט של גנום AAV כי transduce בתאי הרשתית.
לדלל DNAs גנומי מן הרשתיות מוזרק 0.05%תמיסת F 68 פלורונית כדי להגיע לריכוז סופי של ננוגרם אחד לכל microliter עבור כל מדגם. בצעו את ייצור הטיפות בתערובת תגובת PCR של 20 מיקרוליטרים, כולל פריימרים גנומיים ננוגרם אחד 125 ננומולרים ותערובת סופר-על 2x יורגת עד. טען תערובת לדוגמה לחלק האמצעי של המחסנית ליצירת טיפות.
לאחר מכן להוסיף 70 שמן ייצור טיפות מיקרוליטרים לשורה התחתונה של המחסנית. שים את האטם על גבי מחסנית. ודא כי אין פער בין האטם לבין המחסנית.
ואז למקם אותו לתוך מחולל טיפות. יש ליטול בעדינות כ-40 מיקרוליטרים של טיפות הנוצרות בפעמון העליון. הוסף פתרון טיפה לצלחת התגובה PCR 96-Well חצי חצאית.
אטמו את צלחת ה-PCR עם איטום לוחית PCR באמצעות רדיד איטום אלומיניום. מניחים את צלחת ה- PCR לתוך רוכב האופניים התרמי האטום בחום 96-Well. השתמש בפרוטוקול ddPCR המצוין במאמר.
מקם את צלחת ה- PCR בקורא הטיפות כדי לנתח נתונים. לאחר צפייה בסרטון וידאו זה, אתה אמור להיות מסוגל לבצע טכניקת PCR דיגיטלית בסיסית. אתה יכול גם להשתמש בתאים מאומצים עם כמויות קטנות של חומר, שהוא אידיאלי עבור טכניקת PCR דיגיטלי.
עם זאת, עליך להתאים בזהירות את כמות ה- DNA היעד כדי לא לחרוג מהמגבלה של PCR טיפה דיגיטלית. הנה תרשים הזרימה של ההליך הניסיוני. ביצענו הפקה בקנה מידה קטן AAV, אשר ואחריו Titering AAV.
ואז ביצענו הזרקה תוך-ויטמינית. לאחר מכן, כימתנו את עוצמת הפלואורסצנטית על ידי הדמיית פלואורסצנטיות פונדוס. לאחר מכן בודד את רשתיות העכבר וחילץ DNA גנומי מהרשתיות עבור ddPCR.
Titering AAV הוא גם קריטי כדי להיות מסוגל לכמת כראוי התמרת AAV. ddPCR תלוי ביצירת טיפות שיש לה גנום AAV יעד מדולל. תוצאות ddPCR מייצגות מציגות טיפות חיוביות ושליליות עבור הגנום AVV.
חיובי מעל הסף ושלילי הוא להלן. לאחר הכפלה עם גורמי הדילול, titer של AAVs נמצאו להיות 10 עד 12 עותקים גנום למיליליטר. על מנת לכמת נכון את יעילות tranduction AAV, הוזרקו מספר רשתיות.
בעלי חיים מוזרקים צולמו, ופלואורסצנטיות פירושה שעוצמה חושבה. בנקודת זמן של שבועיים, הרשתיות היו מבודדות. ו- ddPCR בוצע באמצעות WPRE ו- 18 פריימרים S.
עוצמת הפלואורסצנטיות של רשתיות מוזרקות AAV היו בקורלציה עם חישובי הגנום AAV, מראה את כוחה של המתודולוגיה. כאן, הראינו מספר טכניקות, כולל הזרקת הכנה AAV בקנה מידה קטן.
