שיטת ההדמיה של תזוזת הריבוע הממוצעת הנכונה', מסוגלת לחלץ בו-זמנית הן את המבנה והן את התכונות הממוצעות הדינמיות של אובייקט ביולוגי של מטרה בדגימה חיה. הדמיית התזוזה הריבועית הממוצעת הנכונה, היא הליך מהיר וחזק, ללא צורך בחילוץ מסלולי אובייקטים בודדים וללא צורך בתיוג מורכב. זה רק דורש הגדרה אופטית סטנדרטית ומושא בעל תווית פלואורסצנטית של עניין.
השיטה סוללת את הדרך להקרנה כמותית בקנה מידה גדול של השינויים המבניים והדינמיים שנמצאו ברמה של ננו-מבנים תת-תאיים במספר מצבים פתולוגיים, כגון סרטן, סוכרת או הפרעות נוירו-ניווניות. מי שידגים את ההליך יהיה פאביו אזארלו, דוקטורנט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בתת-התרבות של התאים, התחילו בשטיפת צלחת של 10 ס"מ שטופלה בתרבית רקמה של תאי הלה מתמזגים, פעמיים, עם 0.01 PBS טוחנים.
לאחר מכן, מוסיפים 1 מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA ומדגרים את המנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך חמש דקות. להשעות מחדש את התאים המנותקים ב -9 מיליליטרים של מדיום DMEM שלם ולאסוף 10 מיליליטרים של מדיום כולל עם טריפסין בצינור הצנטריפוגה. זרעו כ-0.2 מיליון תאים בכל צלחת של 35 מילימטר על 10 מילימטר עם נפח בינוני סופי של 1 מיליליטר, ולאחר מכן דגירו את התאים.
בהתאם למבנה התת-תאי המעניין, נדרשת שיטת תיוג ספציפית, וברגע שתמיסת הסימון מוכנה, שטפו את התאים פעמיים עם 0.01 PBS טוחנים. לאחר החלפת PBS בחומר הצבע המכיל מדיום, דגירה של המנה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני, בהתאם להמלצת היצרן. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם מדיום טרי לפני הניסוי.
לפני ביצוע רכישת הסדרה בהילוך מהיר, הפעילו את מערכת בקרת האינקובטורים של המיקרוסקופ ותנו למיקרוסקופ להשתוות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני, למשך כשעתיים. השתמש בלייזר ארגון 488 ננומטר לעירור של EGFP בתאים טרנספקטים, ובמקרופינזומים בעלי תווית פלואורסצנית, ואסף את פליטת הפלואורסצנציה בין 500 ל-600 ננומטר, באמצעות גלאי צינורות סטנדרטי של מכפיל תמונה. השתמשו בלייזר הליום ניאון של 543 ננומטר כדי לעורר את הצבע הפלואורסצנטי, ולאסוף את הפליטה בין 555 ל-655 ננומטר.
הגדר את קוטר חור הפין לגילוי לגודל של ארי אחד. בנוסף, עבור כל רכישה, לאסוף סדרה של 1000 מסגרות עוקבות. הגדר את זמן השהייה של הפיקסל ל- 2 מיקרו-שניות לפיקסל למשך זמן מסגרת של 129 אלפיות השנייה.
כדי לאתחל כראוי את הפרמטרים האינסטרומנטליים עבור הרכישות, לפתוח iMSD. M עם עורך הטקסט של התוכנה. הגדר את הפרמטרים על-ידי הקלדת ערכים עבור N'כמספר המסגרות בסדרת הזמן, גודל הפיקסלים במיקרומטרים ו- f'as הרזולוציה הזמנית בשניות.
יתר על כן, הגדר קלט תיקון רקע של מסנן לאפס, כדי לעבד תמונות גולמיות, או אחת, כדי לבצע חיסור רקע מבוסס סף. לאחר מכן, הגדר סף אגרת AV לתיקון רקע. אם ערך המסנן מוגדר כערך אחד, פיקסלים בעוצמה נמוכה מערך הסף יוגדרו כאפס.
לאחר מכן, הגדר סיבית כמספר השלם הקובע את דגימת העוצמה. שמור והפעל את ה- iMSD הערוך. קובץ סקריפט M.
בדוק את ביצוע ה- Script בחלון הפקודה, ואם יתרחשו בעיות כלשהן, תוצג הודעת האזהרה המופרעת. לאחר ביצוע סקריפט מוצלח, יבא את ערימת התמונות וחיסר את הרקע, במידת הצורך. לאחר מכן, חשב את פונקציית המתאם הספציו-טמפורלי, בשיטת פורייה.
התאימו את פונקציית המתאם המרחבי-טמפורלי עם פונקציית גאוס הדו-ממדית. לאחר מכן, בדוק את הפלט הגרפי עם עקומת IMSD ועקומות ההתאמה המתאימות, המוצגות בשלושה לוחות נפרדים עבור סוגים שונים של משוואת ההתאמה המשמשת. ערכי ריבוע R מסופקים במקרא התרשים.
לאחר מכן, בדוק את פלט הטקסט. רכישת התמונה של ליזוזום כאבר בדיקה, בוצעה בתאים חיים ברזולוציה הטמפורלית המתאימה, וברזולוציה טמפורלית נמוכה מאוד. העיוות החפץ של הליסוזום עקב תנועת אברונים, נראה בתמונה ברזולוציה נמוכה.
פרופיל העוצמה של הנקודה נגזר באמצעות כלי קו בתוכנת ניתוח התמונה. לאחר מכן, הערכת קוטר הכתם בוצעה, על ידי התוויה ואינטרפולציה של העוצמה על ידי פונקציה גאוסית. הרכישה במהירות גבוהה, הניבה גודל מבנה ממוצע דומה קרוב למדגם הקבוע.
במקום זאת, הרכישה במהירות איטית, הגדילה את גודל המבנה, בשל הדינמיקה של המבנה הטבעי במהלך ההדמיה. התכונות המבניות והדינמיות של מקרופינזומים, נצפו במהלך הסחר. התצפיות חשפו ירידה בגודל הממוצע של המקרופינוזומים.
העלייה המקבילה בתנועה התת-פיזורית, סומנה על ידי ירידה בערכי האלפא. עבור כל רכישה, נצפתה העלייה במספר המקרופינזומים עם הזמן. לעומת זאת, מדידות דומות שבוצעו על ISGs, הציעו התנהגות שונה מאוד של אברונים אלה האחרונים בהשוואה למקרופינזומים.
למעשה, גרגירי אינסולין מראים תכונות מבניות או דינמיות ללא שינוי, מה שמרמז על כך שהם נחקרו במצב נייח. ניתן ליישם את השיטה בקלות במצב של צבע כפול, אם שני אברונים תת-תאיים נפרדים מסומנים באופן שונה. במקרה זה, ניתוח מתאם צולב ידגיש אינטראקציות דינמיות פוטנציאליות של שני האובייקטים בתוך התא.
