לתאים סרטניים יש יכולת יוצאת דופן להפנים חומרים מזינים, כגון ATP, מהסביבה החוץ תאית. הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו להדגים הפנמת ATP ולהמחיש לוקליזציה של ATP בתוך תאים. הדמיה ברזולוציה גבוהה זו של ATP מופנמת, בתוך macropynozomes, היא אידיאלית להבנת לוקליזציה מיוחדת ולהשלמת כמות הניתוח של הפנמה.
הפרוטוקול מתאר יישומים ניסיוניים שונים לחקר הפנמת ATP. שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד מנגנונים שונים של הפנמה תאית, כולל macropinocytosis ואנדוציאטוזיס בתיווך אקסוזום. עבור מחלות מטבוליות, הפנמת ATP בתאים שאינם סרטניים ניתן ללמוד עם פרוטוקול זה.
כדי להתחיל, זרע את התאים הסרטניים בבקבוקון 225 ס"מ רבוע, המכיל DMEM בתוספת FBS ואנטיביוטיקה. אפשר לתאים לגדול ב-37 מעלות צלזיוס וב-5% פחמן דו-חמצני באינקובטור תרבית התאים. לאחר המפגש של 80%, נתק את התאים והשליך את התאים הניתקים על ידי צנטריפוגה, ו resuspend התאים PBS קר קרח כדי להשיג את צפיפות התא של 5 פעמים 10 ל 6 תאים לכל 100 microliters של PBS.
העבר את ההשעיה התאית לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. נקו את אתר ההזרקה על אגף של עכבר חיסוני, עם 75%אתנול, ונגב אתנול עודף עם ניגוב משימה עדין. צייר את התאים למזרק אחד ללא לטקס, מצויד במחט דאייה מדויקת של 27 מד.
להזרקה תת עורית, החזק את המחט בזווית של כ -10 מעלות לעור והכנס את קצה המחט עם שיפוע הפונה מתחת לעור, תוך שמירה רק על מילימטר אחד עד שני מילימטרים של המחט מחוץ לעור. מחלקים את התאים מהמזרק לאט במשך כ-10 שניות. לאחר הזרקת הנפח כולו, להחזיק את המחט במקום במשך שלוש עד חמש שניות ולאחר מכן למשוך את המחט.
יש להפעיל לחץ עדין אך מוצק על אתר ההזרקה למשך שלוש עד חמש שניות באצבעות, כדי למנוע דליפת התוכן המוזרק. לנטר ולמדוד את הגידול באמצעות calipers ורנייה, עד הגידולים להגיע נפח של 200 עד 500 מילימטרים מעוקבים. ממיסים 300 מיקרוליטרים של 16 מיליגרם למיליליטר משקל מולקולרי גבוה dextran ו- DMEM ללא סרום, ודגרה באמבט מים, מזג ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולאחר מכן, צנטריפוגה פתרון dextran ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge חדש 1.5 מיליליטר.
ב 40 microliters, אחד מילימולר לא הידרוליזה ATP מלאי אנלוגי ATP ל 160 microliters של DMEM ללא סרום, כדי להפוך 0.2 מילימולר פתרון ATP פלואורסצנטי לא הידרוליזה. הכן את פתרונות הטיפול של DMEM או שמונה מיליגרם לכל משקל מולקולרי גבוה או נמוך של מיליליטר דקסטרן פלואורסצנטי, עם או בלי 100 ATP פלואורסצנטי לא הידרוליזלזי ב- DMEM, על ידי ערבוב פתרונות המלאי שהוכנו בעבר. השתמש מזרק מיליליטר אחד כדי לאסוף 50 microliters של פתרון טיפול אחד.
הזריקו את הפתרון ישירות לגידול הקסנוגרפט וחזרו על עצמם לארבעה העתקים ביולוגיים של כל טיפול. לאחר המתת חסד של העכבר ובידוד רקמת הגידול, השתמש בכף מחוררת כדי לאסוף את רקמת הגידול שנכרתה ומיד למקם את הרקמה לתוך מדיום קפוא ולגלגל את הרקמה, להבטיח כי הרקמה נשארת שקועה באמבטיות הבינוניות, כל משטחי הרקמה. מניחים בזהירות את הרקמה בתבנית המטביעה המכילה את המדיום המקפיא.
מקם את תג התווית המתאים אנכית לתוך המדיום המקפיא או התבנית, ומוודא שהתווית הכתובה גלויה מחוץ למדיום. כאשר המדיום המקפיא הופך ללבן אטום, הסר את בלוק הרקמה מהתבנית, מניחים את בלוק הרקמה על קרח יבש וחוזרים על הקפאה עבור כל קטע גידול. לאחסן את בלוקי הרקמה במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים לפני הליך cryosectioning.
לאחר ביצוע השקופיות של בלוקים רקמה, לתקן את החלקת מקטע הרקמה שקופיות ב 95%אתנול במינוס 18 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לשטוף את החלק הקבוע עם PBS במשך חמש דקות. מוסיפים 10 עד 50 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה מימי עם DAPI לחלקי הרקמה, בהתאם לגודל המקטעים, ומניחים כיסוי זכוכית להחליק על קטע הרקמה.
לאחר 12 עד 24 שעות של הרכבה, לזהות אזורים של עניין של חלקי הגידול הקבוע ולרכוש את התמונות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כפי שהוכח בעבר. לאחר שעתיים עד 24 שעות של קיבוע תאי הגידול האנושי ועמידה עם DAPI, ללכוד את התמונות באמצעות מערכת הדמיית אפיפלואורסצנטיות ותוכנה לרכישת נתונים. מקם את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ אפיפלורסצנטי זקוף במצב משקפת.
פתח את תוכנית ההדמיה, בחר את המטרה 10 פעמים והתאם את הבמה להגדרת המוקד. סרוק את השקופית משמאל לימין באופן נחשי כדי לזהות את אזורי העניין. בחר את המטרה 40 פעמים והשתמש בלחצן הדו-מצבי במיקרוסקופ כדי לעבור ממצב משקפת למצב לכידת תמונה.
לחץ על סמל איכות חיה כדי להציג ולאחר מכן לרכוש את התמונות. השתמש בחלונית OC בסרגל הכלים לרכישה כדי להגדיר את פרמטרי החשיפה עבור כל קוביית מסנן או ערוץ פלואורסצנטי, ולאחר מכן השתמש בסרגל הכלים לרכישה רב-ערוצית כדי להשיג תמונת שלושה ערוצים עם הגדרות החשיפה המוגדרות. לחלופין, ניתן לרכוש תמונות מרובות ערוצים באופן ידני על-ידי התנדנדות בין קוביות המסנן, קביעת זמן החשיפה, סגירה או פתיחה של התריס בין רכישת תמונה עבור כל ערוץ לבין כיסוי כל תמונה שצולמה עבור ערוצים בודדים.
שמור את התמונה כקובץ nd2. שמור את קבצי TIF, כולל תמונת הערוץ הממוזג ותמונות ערוץ בודדות. השתמש בתכונת ספירת האובייקטים בסרגל הכלים ביאורים ומדידות כדי לספור את מספר NHF-ATP, DEXTRAN פלואורסצנטי במשקל מולקולרי גבוה TMR ותאים חיוביים פלואורסצנטיים במשקל מולקולרי נמוך בקובץ תמונה nd2 שמור ולייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני באמצעות תוכנית הניתוח.
פרוטוקול זה פותח לניתוח מרחבי, זמני וכמותי של הפנמה תאית של ATP שאינו הידרוליזליזה. ההפנמה התאית של ATP פלואורסצנטי לא הידרוליזל הודגם על ידי colocalization של ATP פלואורסצנטי לא הידרוליזלי עם משקל מולקולרי גבוה או נמוך דקסטרן במבחנה, ex vivo ו in vivo. כדי להבטיח שתאי הגידול ישמרו על ATP מופנמ, זמן ניסיוני מוגבל לכל הזרקה תוך-מוראלית להטבעת קריו.
גם להסביר וריאציה תוך-מוראלית על ידי רקמת הדמיה לאורך הגידול. איטרציות עתידיות של השיטה שלנו יכולות לכלול הדמיה בזמן אמת של תהליך ההפנמה של E-ATP, חשיפת מידע על קינטיקה מקרופינוציטוטית וסחר ברקמות ספציפיות.
