הפרוטוקול שלנו מאפשר לחוקרים לחקור את תהליך היווצרות רשת כלי השיט בצורה ברורה וקלה למעקב, פתיחת הדלתות למחקרים חדשים ושפיכת אור על התנהגות כלי הדם. טכניקה זו מציגה את האפשרות של יצירת רשתות כלי דם מאורגנות מאוד חוזר עם להגיב לסביבה שמסביב. תאים אנדותל מחולים הסובלים ממחלת כלי דם ניתן לאחזר באמצעות מערכת זו, מה שמאפשר לשחזר את מחלת כלי הדם ולמצוא טיפול מתאים.
השיטה המוצעת ניתן להרחיב לחקר התנהגות רשת כלי הדם כאשר יחד עם סוגי תאים שונים, המאפשר לבחון את האינטראקציה של כלי פיתוח עם סוג רקמה ספציפי. התחל על ידי שקיעת הפיגומים ב 70% אתנול במשך מינימום של 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם פעמיים PBS. יש לערבב 1.5 מיקרוליטרים של תמיסת מלאי פיברונקטין עם 28.5 מיקרוליטרים של PBS לפיגום.
הכן דילול פיברונקטין אחד שישמש עבור כל הפיגומים כדי למנוע שגיאות pipetting. מניחים את הפיגומים בדלילות על גבי משטח הידרופובי ומכסים כל פיגום עם 30 מיקרוליטרים של דילול פיברונקטין. החלף את מכסה הלוח והכנס את הפיגומים המכוסים בפיברונקטין לאינקובטור שנקבע ל-37 מעלות צלזיוס ולחות של 100% למשך שעה לפחות.
לאחר הדגירה, לשטוף קלות את הפיגומים PBS כדי להסיר שרידים fibronectin. הפיגומים יכולים להישמר ב- PBS בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. הכן תא אנדותל או מדיום EC על ידי ערבוב המדיום הבסיסי עם רכיבי הערכה הבינונית המתאימים, כולל פתרון אנטיביוטי, FBS, ותוספי צמיחת תאי אנדותל כפי שצוין על ידי היצרן.
הפוך את ההשעיה תא אנדותל microvascular שומן אנושי במדיום EC עם ריכוז של ארבעה מיליון תאים למיליליטר. בעזרת מלקחיים, מניחים פיגום אחד מצופה פיברונקטין לבאר בצלחת 24 באר שאינה TC. מכסים כל פיגום ב-25 טיפות מיקרוליטר של השעיית התא, ומוודאים שלא ניתן להשעיה לזרום הרחק מהפיגום.
שים את המכסה על הצלחת ומניחים אותו באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו 100% לחות במשך 60 עד 90 דקות. לאחר הדגירה, מלאו כל באר ב-700 מיקרוליטרים של מדיום EC. דגירה פיגומים אנדותל עד מפגש EC ניתן לראות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או במשך שלושה ימים.
לשנות את המדיום כל יומיים. הכן מדיום DPSC על ידי ערבוב 500 מיליליטר של DMEM גלוקוז נמוך, 57.5 מיליליטר של FBS, 5.75 מיליליטר של חומצות אמינו לא חיוניות, 5.75 מיליליטר של גלוטמקס, ו 5.75 מיליליטר של פתרון פניצילין סטרפטומיצין-נייסטטין. מעבירים את הפיגומים עם האנדותל לצלחת חדשה שאינה TC 24 באר.
השלך את כל המדיה מהצלחת הנוכחית באמצעות פיפטה או יניקת ואקום, מקפיד לא להחיל ואקום ישירות על הפיגום. מניחים פיגום אחד במרכז כל באר, ואז לייבש את האזור שמסביב עם ואקום קל. לדלל פתרונות מלאי תרומבין ופיברינוגן עם PBS לריכוז סופי של חמש יחידות למיליליטר ו 15 מיליגרם למיליליטר בהתאמה.
הכינו השעיה של שמונה מיליון DPSC למיליליטר בדילול תרומבין והפיצו 12.5 מיקרוליטרים של המתלים למיקרו-צינורות בודדים לפיגום שייזרעו. הגדר פיפטה של 5 עד 50 מיקרוליטר ל-12.5 מיקרוליטר ומלא אותה בתמיסת פיברינוגן. מבלי להסיר את הקצה, הגדר את הפיפט ל-25 מיקרוליטרים.
החומר בקצה צריך לעלות ולהשאיר נפח ריק. לחץ לאט על כפתור הכועף עד שהנוזל מגיע לפתיחת הקצה, אך אינו דולף החוצה. החזק את הוכנה במצב זה ולשים את הקצה לתוך אחד הצינורות microcentrifuge המכילים את התאים המתלים תרומבין, לוודא את הקצה הוא במגע עם הנוזל.
שחרר בעדינות את לחצן הכועף ומשוך את המתלה של התא לקצה. ביסודיות לערבב את שני החומרים, הימנעות היווצרות בועה. מחלקים במהירות את החומרים המעורבים על גבי פיגום אנדותל.
חזור על השלבים הקודמים עבור כל פיגום, הקפד לשנות טיפים בין שימושים כדי למנוע היווצרות ג'ל פיברין בלתי צפוי בתוך הקצה. החלף את מכסה הצלחת ודגר את הפיגומים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני ו-100% לחות למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, מלאו כל באר במיליליטר אחד של DPSC אחד לאחד ובינוני EC.
תרבות לשבוע אחד, שינוי המדיום כל יומיים. בנקודות זמן שונות במהלך התרבות, להסיר את המדיום מן הבאר תמונה המבנים באמצעות מיקרוסקופ confocal ללמוד את התפתחות כלי הדם או כל פרמטר אחר של עניין. פרוטוקול זה מאפשר ייצור של פיגומים tessellated עשוי SU-8 photoresist.
הושגו פיגומים עם גיאומטריות תא נפרדות ותכונות מדויקות וחוזרות על עצמן. עם זריעה סימולטנית מסורתית של תאי אנדותל ותאי תמיכה, התאים הופצו באופן הומוגני על הפיגום וכתוצאה מכך רשתות כלי דם בלתי צפויות ולא מאורגנות. להיפך, זריעת תאים חורגת הביאה לרשתות כלי דם מאורגנות מאוד.
בעת שימוש בתאי אנדותל פלואורסצנטיים, ניתן לדמות את כלי הדם בזמן אמת. חלבון פלואורסצנטי אדום המבטא תאי אנדותל היה מתורבת על פיגומים משושים ודימוי. תאי התמיכה נוספו ביום הראשון ורשתות כלי הדם צולמו כל יומיים כדי לכמת את התפתחות כלי השיט.
עבור כל נקודת זמן, תמונות רחבות של הפיגום כולו נלקחו. צמיחת כלי השיט כמתה כאורך כלי שיט ושטח כוללים. בוצעה הדמיה קונפוקלית של זמן לשגות כדי לאפשר מעקב אחר כלי שיט יחיד באמצעות תאי אנדותל צבעוניים.
נתיב הספינה נוצר מהזמן לשגות, מה שמאפשר לצפות בנדידת כלי שיט. התבגרות כלי נצפתה על ידי נוכחות של actin שריר חלקה ותאי תמיכה. עבור התאים המעגליים, המשושה והמרובעים, התאים מתרבים ומתארגנים למבנים.
ביום השביעי, כל הצורות הראו רשת כלי דם עשירה ומורכבת. תמונות הגדלה גבוהות יותר חשפו אקטין שרירים חלק צפוף יותר ונוכחות תא תמיכה במשותף עם כלי נוצר, מעורר גיוס תא תמיכה ובידול סביב מבני כלי הדם. טכניקה זו יכולה לשמש כדי ללמוד את ההתנהגות של רשתות כלי דם תלת מימדיים כאשר נחשפים לתנאים שונים, כגון מעכבי תאים ספציפיים או בנוכחות סוגי תאים נוספים.
