היפוקסיה היא מניע מרכזי של התפתחות סרטן שגורם לחוסר יציבות גנומית וגידול. אנו מדגימים שיטה ליצירת היפוקסיה מרכזית בסרטן מוצק במבחנה המבוססת על טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת מימדית. בשיטה זו, ניתן לשחזר שיפוע היפוקסי רדיו באמצעות אסטרטגיה פשוטה המשלבת מחסום חדיר גז מודפס 3D וכיסוי זכוכית.
זה סרטן היפוקסי על שבב הטכנולוגיה ניתן להשתמש כדי לחזות את יעילות התרופה כדי להקל על מרשם תרופות נגד סרטן ספציפי לחולה. וזה גם צפוי לאפשר אבחנה מהירה של סרטן אגרסיבי. כדי לסייע בהכנת תמיסת קולגן מנוטרלת של שלושה מיליליטר לפני הג'ל, חותכים ספוגי קולגן של 30 מיליגרם לחתיכות בריבוע של חמישה על חמישה מילימטרים.
מניחים את החלקים לתוך בקבוקון זכוכית סטרילי 10 מיליליטר ומוסיפים 2.4 מיליליטר של 0.2 מיקרון מזרק מסנן 0.1 חומצה הידרוכלורית נורמלית לבקבוקון עבור דגירה של שלושה ימים בארבע מעלות צלזיוס ו 15 מהפכות לדקה. לאחר העיכול, מסננים את כל חלקיקי הקולגן הלא מעוכלים באמצעות מסננת תאי מיקרון 40 ומאחסנים את תמיסת הקולגן החומצי בארבע מעלות צלזיוס עד שבעה ימים. כדי להתאים את ה- pH של תמיסת קולגן טרום ג'ל מנוטרלת 1%, להוסיף 30 microliters של פתרון אדום פנול לריכוז הסופי של 1%ו 300 microliters של 10X PBS לריכוז הסופי של 10%לאחר ערבוב וצנטריפוגה, להשתמש אחד הידרוקסיד נתרן נורמלי כדי לנטרל את ה- pH לשבע, אימות שינוי הצבע ולהוסיף מים מזוקקים כדי להשיג נפח כולל של שלושה מיליליטר.
לאחר מכן לאחסן את ה-pH מותאם 1%מנוטרל פתרון קולגן מראש ג'ל ב 4 מעלות צלזיוס לשימוש בתוך שלושה ימים. כדי לבדוק מראש את הג'לציה של תמיסת קולגן טרום ג'ל מנוטרלת, השתמש פיפטה עקירה חיובית להוסיף 50 microliters של טיפות קולגן למנה קטנה דגירה טיפות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. בסוף הדגירה, בדוק אם הקולגן השתנה מצבע שקוף ללבן אטום.
להטות את המיכל כדי לאשר כי הקולגן הוא לדבוק בחלק התחתון של המיכל. ויוצקים PBS על הטרופה כדי לאשר כי מבנה הקולגן אינו לשבור את הפתרון. להדפסה תלת-ממדית של תבנית PEVA, לחצו על 'קובץ' ושמרו את סוג הקובץ כ-STL להמרת קובץ ה-CAD בתלת-ממד לקובץ STL ולחצו על 'Option' וטופס פלט כ-ASCII ליצירת קוד ה-G.
כדי לייבא את קובץ ה- STL שנוצר, לחץ על קובץ ופתח את קובץ STL ובחר את קובץ ה- STL שנשמר. כדי ליצור באופן אוטומטי את קוד ה-G של תבנית PEVA ההקרבה, בחר את דגם הפרוסה של מחליף STL-CAD. לאחר מכן כדי ליצור נתיבי הדפסה לייצור השבב, השתמש זרבובית דיוק 50 מד בלחץ פנאומטי של 500 קילופסקלים ב 110 מעלות צלזיוס כדי להדפיס את עובש PEVA הקרבה על שקופית היסטולוגיה הידרופילית דבק סטרילי.
כדי להטיל את מחסום PDMS, ערבב שישה מיליליטרים של אלסטומר בסיס PDMS ו 600 microliters של חומר ריפוי במשך חמש דקות במאגר פלסטיק ולטעון את הפתרון מעורבב הומוגנית לתוך מזרק חד פעמי 10 מיליליטר. מצויד במזרק עם קצה מחלק מחודד מפלסטיק 20 מד ולמלא את עובש PEVA הקרבה עם פתרון PDMS מעורבב. ה- PDMS הממוזג ימלא תבנית PEVA הקרבה זו במשטח קמור והמחסום יהיה גבוה יותר מזה של התבנית.
לאחר ריפוי מחסום PDMS בתנור 40 מעלות צלזיוס במשך יותר מ -36 שעות כדי למנוע המסת PEVA, להשתמש בזוג פינצטה מדויקת כדי לנתק את עובש PEVA הקרבה לעקר את מחסום חדיר הגז ב 120 מעלות צלזיוס במובלעת אוטומטית. כדי לערבב את הפתרון עם תאים סרטניים, resuspend כל סוג של גלולת תא שנאסף ב 20 microliters של מדיום תרבות ולהוסיף מיליליטר אחד של 1% מנוטרל פתרון קולגן מראש ג'ל לתוך כל אחד מתלי תאים לשימוש חוזר על קרח רטוב עם ערבוב עדין. השתמש פיפטה תזוזה חיובית לערבב כל השעיה תא.
כאשר מתקבלים פתרונות הומוגניים, השתמש פיפטה חד פעמית חיובית להעביר את bioinks קולגן עטוף התא לתוך מזרקים חד פעמיים בודדים שלושה מיליליטר ולאחסן את המזרקים בארבע מעלות צלזיוס עד הדפסת תאים 3D. להדפסה תלת-ממדית של טבעות קונצנטריות סרטן סטרומה, להמיר את קובץ 3D CAD המתאים לפורמט קובץ STL ולהשתמש מחליף STL-CAD כדי ליצור G-קוד של טבעות קונצנטריות סרטן סטרומה. טען את הביו-לינקים של הקולגן המכומסים של התא לראש המדפסת התלת-ממדית והגדר את טמפרטורת הראש והצלחת ל-15 מעלות צלזיוס.
לטעון את נתיב ההדפסה שנוצר על תוכנת הבקרה של מדפסת 3D ולחץ על התחל להדפיס את bioinks קולגן על מחסום חדיר גז על פי G-code טעון עם מחט פלסטיק 18 מד בלחץ פנאומטי של כ 20 קילופסטלים ב 15 מעלות צלזיוס. בסוף כל פעולת הדפסה, למקם באופן ידני כיסוי זכוכית מעוקר 22 על ידי 50 מילימטר על גבי מחסום חדיר הגז כדי ליצור את השיפוע היפוקסי. לאחר יצירת שלושה סרטן היפוקסי על שבבים להעביר את השבבים לחממה 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת לחצות את bioinks קולגן.
כאשר כל סרטן היפוקסי על שבבים הודפסו, בעדינות שפשף את משקפי הכיסוי על גבי מחסומי גז חדירים עם מגרד תאים עבור מליטה הדוקה. כדי לרענן את המדיום של תרבות התאים לשבבים מבלי לנתק את מבנה הסרטן, הטה את השבבים והשתמש בפיפט כדי להציג 1.5 מיליליטר של מדיום צמיחת תאי אנדותל לצד כל שבב. סרטן היפוקסי על שבב תוכנן בצורה של טבעות קונצנטריות לחקות את דיפוזיה חמצן רדיאלי דלדול נצפתה ברקמות סרטן.
לאחר הגדרת נפח הבקרה של מרחב שבו חמצן מפוזר ונצרך על ידי תאים, ניתן לקבוע צפיפות תאית מתאימה ליצירת היפוקסיה מרכזית באמצעות ניתוח אלמנט סופי חישובי. עם הדפסת תאים 3D, מבנה טבעת קונצנטרי סרטן סטרומה ממודר יכול להיווצר כדי לשחזר את התכונות האנטומיות של סרטן מוצק. מבחינה כמותית, הכדאיות של התאים לאחר ההדפסה היא בדרך כלל גדולה מ-96%, מה שמאשר שתנאי הייצור מתאימים לסרטן ולתאי סטרומה.
בניתוח מייצג זה, שתי קבוצות הושוו על פי נוכחות והיעדר שיפוע החמצן כדי לאמת את ההשפעות של שיפוע היפוקסי על התקדמות הסרטן. בשני התנאים היו בתאי אנדותל CD31 חיוביים בתוך האזורים ההיקפיים, מה שמצביע על כך שמבנים חיים בעלי תבנית מרחבית יוצרו באמצעות טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית. בהשוואה למצב שלילי שיפוע חמצן המצב החיובי שיפוע הפגין שיפוע היפוקסי, המציין את הביטוי ההדרגתי של אלפא HIF1.
SHMT2 תאים פסאודופליסד חיוביים SOX2 תאים פלוריפוטנטיים חיוביים נצפו גם, המעיד על נוכחות של תכונות פתופיזיולוגיות אגרסיביות של סרטן מוצק. סרטן היפוקסי על שבב הוא כלי שימושי לחקירת המאפיינים הפתופיזיולוגיים של סרטן מוצק ואת crosstalk דינמי בין תאים סרטניים tumorigenesis קידום microenvironment. מכיוון שניתן להתאים את המתודולוגיה לעיצוב תרופה ספציפית לחולה בפרק זמן סביר, גישה זו צפויה לגשר על הפער בין מודלים של סרטן vivo ו- in vitro.
