Name: an improved assay and tools for measuring mechanical nociception in drosophila larvae
Uploaded: 2020-10-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae at JoVE.com

אנו מודים לתומס וואנג על פיתוח אב הטיפוס פון פריי, פטריק ג'יי הואנג על שיפור הבדיקה המכנית, מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה על השליטה (w1118) ו- ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP טסים, וחברי מעבדת גלקו על קריאת כתב היד באופן ביקורתי. עבודה זו נתמכה על ידי R21NS087360 ו R35GM126929 ל MJG.

1. בניית בדיקה מכנית
<ol><li>חותכים כל חוט ניטינול (איור 1B), בניצב לציר הארוך שלו, לאורך שצוין (איור 1M-N) באמצעות חותך תיל קטן (איור 1C). הסיבים מגיעים בשלושה קטרים שונים שנקבעו מראש (איור 1B). הערה: האורכים המפורטים כאן הם מדריך להשגת הלחצים המשוערים שצוינו, באמצעות פרוטוקול דומה לבניית ההר. בסופו של דבר, ללא קשר לאורך חתך הסיבים, ועומק החור בהר, יש למדוד / לכייל את הסיבים על איזון כדי להשיג את ערך הכוח / הלחץ המדויק.</li>
	<li>בדוק את קצה הסיב תחת סטריאומיקרוסקופ כדי להבטיח שלא יישארו קצוות חדים או לא סדירים מכיוון שאלה עלולים לגרום נזק לרקמות לעור הזחלים ולהפריע לכיול.</li>
	<li>החלק ידנית את הקצוות החדים של הגשושית המכנית באמצעות אבן חידוד עד שלא יימשכו אי-סדרים חדים(איור 1D).</li>
	<li>לעשות חור לקראת הסוף של מקל ארטיק עץ (איור 1E) באמצעות מחט hypodermic (ראה לוח החומרים). הכנס את המחט לפחות באמצע גובה מקל הארטיק (איור 1E). זה יוצר תא להחדרת חוט הניטינול.</li>
	<li>מרחו דבק עץ על חוט ניטינול יחיד (איור 1F)והכניסו את חוט הים מצופה הדבק לחריץ המחט במקל ארטיקמעץ (איור 1G). אפשר להתייבש במשך ~ 5 שעות.</li>
	<li>כייל כל בדיקה מכנית על-ידי לחיצה עליה כנגד סולם עד שהגשושית המכנית תתכופף (איור 1H-L). זוהי הנקודה של כוח מקסימלי שניתן לרשום גרם. בהתאם לקוטרי הסיבים (מוגדרים מראש) והאורכים (שנקבעו על ידי המשתמש) ניתן ליצור מגוון רחב של כוחות ולחצים.</li>
	<li>המר את המסה שנרשמה בשלב 1.6 כדי לכפות במילינוטון (mN) באמצעות הנוסחה f = ma (כוח שווה למסה כפול תאוצה כבידתית). ו: כוח; ז: מסה; a: האצת כבידה (9.8מטר/שניה 2)(איור 1M).</li>
	<li>לבסוף, המר את הכוח המחושב ללחץ (כוח/אזור) בקילפסקאל (kPa) על-ידי חלוקת הכוח הנמדד לפי שטח הפנים של קצה הסיב (איור 1M). כדי לחשב את האזור, להמיר את הקוטר של חוטי nitinol שונים מ אינצ'ים (0.04", 0.06", ו 0.08") לסנטימטרים. לאחר מכן, πr2 (שם, r = רדיוס חוטי הניטינול) קובע את האזור (ראה איור 1M). הכנת בדיקות מרובות באמצעות חוטים בקוטרים ובאורכים שונים תיצור ערכה מלאה המשתרעת על פני טווח התגובה לזחלים של דרוזופילה (ערכת מדגם המוצגת באיור 1N). הערה: בדוק כל בדיקה מכנית לפחות כל 3-4 שבועות. כאשר הלחץ חורג ביותר מ-± 3% מהמדד המקורי, יש לפברק בדיקה מכנית חדשה.</li>
</ol>2. הכנת זחלים
<ol><li>העלה את זן הבקרה(w1118)צאצאי זחלים או זחלים המכילים את הטרנסגנים ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP (להדמיית נזק לנוירונים חושיים) על מזון סטנדרטי באינקובטור 25 °C (60 °F). בדרך כלל, מניות נשמרים באופן שגרתי ב 18 °C (69 °F), אבל שני ההורים וצאצאי הזחל גדלים ב 25 °C (69 °F) על מזון קמח תירס סטנדרטי לניסויים. הערה: זבובים בוגרים (חמישה זכרים ועשר נקבות, יחס 1:2) נשמרים בבקבוקוני הזבוב, כדי לאפשר הטלת ביצים, כ-24 שעות. הזמן לאחר הטלת ביצים (AEL) מתחיל ממתי המבוגרים מוסרים.</li>
	<li>לאסוף את הזחלים instar השלישי, לאחר כ 96 שעות של הטלת ביצה, על ידי התזת בעדינות מי ברז לתוך מזון זבוב רך המכיל את הזחלים. זחלים נודדים שעזבו את האוכל, או שהתנצחו על ספירקלים אצטרוריים או אחוריים, גדולים / ישנים מדי לבדיקה זו. זחלי instar השני (~ פחות מ 4 מ"מ אורך) הם קטנים מדי.</li>
	<li>יוצקים את תכולת המזון הזבוב הרך לצלחת פטרי בגודל סטנדרטי נקי (100 מ"מ x 15 מ"מ).</li>
	<li>בעזרת מלקחיים, מיין כוכב שלישי בינוני, בגודל בינוני, זחלים (ראו איור 2A)מזחלים קטנים יותר (כוכב שני ובכוכב שלישי מוקדם) או זחלים גדולים יותר (כוכב שלישי מאוחר או נודד). מומלץ לבצע מניפולציה עדינה עם מלקחיים כדי למנוע נזק לרקמות לזחלים. הערה: ההעברה באמצעות מלקחיים מבוססת בעיקר על מתח מים ולא על ידי הפעלת לחץ על הזחלים עם להבי המלקחיים. חלופה לשימוש במלקחיים לתמרון זחלים היא מברשות צבע רכות. עם כל אחד מהכלים, המשתמש צריך לתרגל העברת בעלי החיים, כדי לא לגרום נזק לרקמות לא מכוונות שעלול לסבך מדידות התנהגותיות.</li>
	<li>מעבירים את זחלי ה-instar האמצעיים, באמצעות מלקחיים, לצלחת פטרי קטנה (30 מ"מ x 15 מ"מ) המכילה תקע קטן של מזון מעופף לח במים בטמפרטורת החדר. שמור את הזחלים בצלחת פטרי הקטנה עד הניסויים מבוצעים, אבל לא יותר מ 20 דקות. הערה: בדרך כלל, העברת 20-30 זחלים לתקע המזון ייתן מספר הולם במשך 20 דקות של מבחנים התנהגותיים.</li>
</ol>3. מבחני תפיסה מכניים
<ol><li>הנח זחל אינסטאר באמצע השלישי (באמצעות מלקחיים) על משטח דק של ויניל שחור או כהה תחת סטריאומיקרוסקופ שדה בהיר. הצבע הכהה מספק ניגודיות המשפרת את ההדמיה של הזחל. עדיף לקבל חתיכת ויניל כהה מטלטלין בחופשיות כי זה מאפשר למשתמש ליישר את הזחל מבלי לגעת או לפגוע בו.</li>
	<li>שים את אורות הסיבים האופטיים בין עדשות המטרה מיקרוסקופ כרית ויניל שחור או כהה; זה יאפשר תאורת ניגודיות גבוהה נאותה לראיית הזחל.</li>
	<li>השלך זחלים שאינם מפגינים תנועה רגילה לאחר ההעברה לפנקס. אלה יכולים להפריע לתגובה התנהגותית nociceptive נורמלי. לתנועה רגילה, ראה וידאו 1.</li>
	<li>לנגב, באמצעות מגבת נייר, כל מים עודפים המקיפים את הזחל שעלול לגרום הזחל לצוף על כרית ויניל.</li>
	<li>כוון את הזחל על ידי הזזת כרית הויניל הכהה. הראש/הפה של הזחל צריך להצביע שמאלה אם אתה ימני ולהיפך אם אתה שמאלי(איור 2A-B).</li>
	<li>החל את החללית המכנית שנבחרה, בדרך כלל עבור 1-2 שניות, על הצד הגבי האחורי של הזחל בחלק הבטן בקירוב A8 (ראה איור 2B),עד שהגשושית מתכופפת ומעוררת את כמות הלחץ שנמדדה קודם לכן (איור 2C). חשוב שהגשוש ילחץ על פני השטח הגביים של הזחל וידחס את הזחלים לתוך הפנקס שמתחת בנקודת המגע של הגשוש. הערה: בנקודת המגע בין קצה חוט הניטינול לבין קוטיקל-אפידרמיס הגב, בדיקות נמוכות מ -2,300 kPa, בעיקר להתכופף מבלי לחדור את הקוטיקל ואת הרקמות הבסיסיות. בדיקות כאלה משפיעות לעתים רחוקות על תמותתהזחלים 4. בלחצים גבוהים יותר (>5,000 kPa) הבדיקות הן להתכופף, מדי פעם, לחדור את הקוטיקל ואת הרקמות הבסיסיות. ניקוב הזחלים פוגע בהישרדות הזחלים4, ואם נצפה, זחלים אלה מושלכים בדרך כלל מניתוח התנהגותי.</li>
	<li>רשום את התגובה ההתנהגותית עבור כל זחל. תגובה nociceptive חיובית (וידאו 2) מצוין אם הזחל מראה גליל שלם של 360 ° לאורך ציר גופו בתוך 3 s. תגובות אחרות (ניסיון להסתובב, זחילה מהירה ומתנועע) נחשבות שליליות לצורך מבחנה זו. הערה: זחלים מגורה עם גירוי מכני subthreshold (200 kPa) לא לעורר את התגובה nociceptive טיפוסי או מתגלגל (וידאו 3). זחלים מסוימים אכן הציגו תגובות מגע מהירות קדימה או קלות כגון שינויים בכיוון התנועה.</li>
	<li>השלך את הזחל והכן את הבא לבדיקה, חוזר על שלבים 3.1 עד 3.7.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.1–3.7 עד להגעה למספר הזחלים הרצוי (שלוש עד שש קבוצות של n = 10 זחלים שימשו כאן עבור כל גשוש). הערה: בעת שימוש בבדיקות מכניות בלחץ נמוך יותר (174-462 kPa), הבדיקה תיקח יותר זמן לכל זחל. הסיבה לכך היא כי קצה חוטים ארוכים יותר מתנדנד יותר, מה שהופך אותו קשה יותר לתקוע את הזחל במרכז קטע A8. תרגול הוא הכרחי עם בדיקות אלה.</li>
</ol>4. מיקרוסקופיה קונפוקלית להערכת מורפולוגיה עצבית
<ol><li>מניחים זחל (של גנוטיפ ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP כדי לתייג נוירונים חושיים) מגורה בעבר עם חוט ניטינול לתוך תא האתריזציה בתוך צנצנת קופלין המכיל 10 מ"ל נושא כדור צמר גפן ספוג ~ 1 מ"ל של אתר diethyl. תן לזחל לשבת בתא ~ 5 דקות. הערה: פרוטוקול מפורט לאתריות מסופק במחקר קודם שפורסם על ידי הקבוצה שלנו12.</li>
	<li>שוטפים את הזחל בעדינות מתא האתריזציה לצלחת פטרי קטנה.</li>
	<li>הכינו שקופית מיקרוסקופ אחת, שני כיסויים קטנים (22 x 22 מ"מ) וכיסוי אחד ארוך (22 x 54 מ"מ) (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>הוסף טיפות קטנות של אתר:פתרון שמן (1:5 יחס של אתר אתיל לתמיסת שמן halocarbon, ראה טבלה של חומרים) לשני קצות השקופית, ולאחר מכן למקם את כיסויים קטנים על גבי טיפות קטנות. סידור זה יוצר פער חלל קטן שבו הזחל יכול להתאים. הערה: לחץ על הכיסויים הקטנים כנגד שקופית המיקרוסקופ עד שיהיה קשה להחליק.</li>
	<li>הוסף כמה טיפות של אתר:פתרון שמן באמצע שקופית המיקרוסקופ ולאחר מכן למקם את הזחל, באמצעות מלקחיים, על מרכז שקופית מיקרוסקופ (בין coverslips קטן). ודא כי הציר הקדמי של הזחל מקביל לצד הקצר של השקופית וכי הצד הגבי פונה כלפי מעלה.</li>
	<li>מכסים את הזחלים עם כיסוי ארוך ממוקם על גבי הזחל ואת שני כיסויים קטנים יותר. הערה: לחץ בנדיבות על הכיסוי הארוך עד שהזחל כמעט שטוח.</li>
	<li>קטע תמונה A8 של הזחל באמצעות מיקרוסקופ confocal (ראה טבלה של חומרים)באמצעות אורך גל לייזר 488 (GFP). הערה: תמונה הזחל מיד בגלל הרדמה דרך אתר יתפוגג במהירות (~ 5-10 דקות) ואת הזחל יתעורר ולזוז, אשר יסבך הדמיה נוספת.</li>
	<li>לכוד תמונות מחסנית Z ברזולוציה של 1024 x 1024 פיקסלים באמצעות צמצם מספרי 20x (NA) 0.7 עדשה אובייקטיבית יבשה בזום 1x, גודל צעד של 1.5 מיקרומטר.</li>
</ol>5. כמות של נזק לרקמות
<ol><li>אסוף והמר את תמונות הערימה מסדרת Z, מסעיף 4.8, להקרנת Z יחידה (שיטוח של תמונות מרובות שצולמו במישורי מוקד שונים לתמונה אחת ללא הפרדות צבע). זה יכול להתבצע באמצעות תוכנה מסחרית זמינה (למשל, אולימפוס Fluoview) או כל פלטפורמת קוד פתוח שווה ערך, למשל, פיג'י / תמונה J. שמור את הקרנת Z יחיד בפורמט TIFF.</li>
	<li>פתח את תוכנית ניתוח התמונה פיג'י/ImageJ.</li>
	<li>לחץ על קובץ, מתוך שורת התפריטים ובחר פתח מהחלון המוצג.</li>
	<li>בחר את הקרנת התמונה הבודדת המאוחסנת, שנשמרה בתבנית TIFF, שיש לנתח.</li>
	<li>לחצו על 'עריכה'מתוך שורת התפריטים ובחרו באפשרות 'היפוך' מהחלון המוצג.</li>
	<li>לחץ על התמונה, מתוך שורת התפריטים ולאחר מכן בחר התאם, מהחלון המוצג, ולבסוף בחר באפשרות בהירות/ניגודיות.</li>
	<li>בחרו באפשרות 'צורה ביד חופשית' מתוך סרגל הכלים למדידת אזור הרווח (אם קיים).</li>
	<li>לחצו על 'נתח'מתוך שורת התפריטים ובחרו באפשרות 'מדידה'. זה יציג את האזור של הפער או הפצע.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Painless,+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception.">Painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113 (2), 261-273 (2003).</li><li>Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pickpocket+is+a+DEG/ENaC+protein+required+for+mechanical+nociception+in+Drosophila+larvae.">Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae.</a> Current Biology. 20 (5), 429-434 (2010).</li><li>Lopez-Bellido, R., Himmel, N. J., Gutstein, H. B., Cox, D. N., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+for+chemical+nociception+in+Drosophila+larvae.">An assay for chemical nociception in Drosophila larvae.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 374 (1785), 20190282 (2019).</li><li>Lopez-Bellido, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+signaling+regulates+mechanical+nociception+in+flies+and+vertebrates.">Growth factor signaling regulates mechanical nociception in flies and vertebrates.</a> Journal of Neuroscience. 39 (30), 6012-6030 (2019).</li><li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+integration+and+neuromodulatory+feedback+facilitate+Drosophila+mechanonociceptive+behavior.">Sensory integration and neuromodulatory feedback facilitate Drosophila mechanonociceptive behavior.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1085-1095 (2017).</li><li>Kim, S. E., Coste, B., Chadha, A., Cook, B., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Drosophila+Piezo+in+mechanical+nociception.">The role of Drosophila Piezo in mechanical nociception.</a> Nature. 483 (7388), 209-212 (2012).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Current Biology. 19 (10), 799-806 (2009).</li><li>Babcock, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+regulates+nociceptive+sensitization.">Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization.</a> Current Biology. 21 (18), 1525-1533 (2011).</li><li>Turner, H. N., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury-induced+cold+sensitization+in+Drosophila+larvae+involves+behavioral+shifts+that+require+the+TRP+channel+Brv1.">Injury-induced cold sensitization in Drosophila larvae involves behavioral shifts that require the TRP channel Brv1.</a> PloS One. 13 (12), 0209577 (2018).</li><li>Im, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tachykinin+acts+upstream+of+autocrine+Hedgehog+signaling+during+nociceptive+sensitization+in+Drosophila.">Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila.</a> eLife. 4, 10735 (2015).</li><li>Cervero, F., Merskey, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+noxious+stimulus.">What is a noxious stimulus.</a> Pain Forum. 5 (3), 157-161 (1996).</li><li>Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+global+methods+of+assessing+thermal+nociception+in+Drosophila+larvae.">Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3837 (2012).</li><li>Follansbee, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+nociceptive+sensitization+requires+BMP+signaling+via+the+canonical+SMAD+pathway.">Drosophila nociceptive sensitization requires BMP signaling via the canonical SMAD pathway.</a> Journal of Neuroscience. 37 (35), 8524-8533 (2017).</li><li>Im, S. H., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+insulin+receptor+regulates+the+persistence+of+injury-induced+nociceptive+sensitization.">Drosophila insulin receptor regulates the persistence of injury-induced nociceptive sensitization.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (5), (2018).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+caspase+activity+is+required+independently+of+apoptosis+to+produce+active+TNF/Eiger+during+nociceptive+sensitization.">Drosophila caspase activity is required independently of apoptosis to produce active TNF/Eiger during nociceptive sensitization.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (5), 2786 (2017).</li><li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Current Biology. 17 (24), 2105-2116 (2007).</li><li>Guo, Y., Wang, Y., Wang, Q., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+PPK26+in+Drosophila+larval+mechanical+nociception.">The role of PPK26 in Drosophila larval mechanical nociception.</a> Cell Reports. 9 (4), 1183-1190 (2014).</li><li>Takagi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+connectivity+of+homologous+command-like+neurons+mediates+segment-specific+touch+responses+in+Drosophila.">Divergent connectivity of homologous command-like neurons mediates segment-specific touch responses in Drosophila.</a> Neuron. 96 (6), 1373-1387 (2017).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שינינו בדיקה מכנית הוקמה1,2,16 באמצעות בדיקות מכניות מותאמות אישית מפוברק חוטי ניטינול. סגסוגת מתכת זו מאפשרת לנו להשתמש חוטים בקוטר קטן יותר המתאימים לגודל של זחלי Drosophila. מונופילמנטים מבוססי קו דיג שלטו בתחום nociception מכני לטוס עד כה2,5,6,16. חוטי הניטינול שלנו שומרים על צורתם ומדדו לחץ במשך כ -3-5 חודשים (מניסיוננו). על ידי שינוי האורך והקוטר של חוטי הניטינול, המשתמש יכול ליצור מגוון רחב של לחצים המשתרעים מתת-כותרת לתגובה מתגלגלת כמעט מלאה. בפרט, ביצוע בדיקות subthreshold הוא פשוט יותר עם חוטי ניטינול בקוטר קטן יותר. באמצעות בדיקות אלה, מצאנו כי לחץ, ולא כוח, מעורר תגובות התנהגותיות nocifensive עקבי יותר4. אנו מדגימים כאן, באמצעות מודל רגישות nociceptive UV-induced מבוסס היטב7,10,13, כי חוטים אלה הם גם כלי שימושי לחקר רגישות יתר מכנית – allodynia ו hyperalgesia.
מחקרים קודמים באמצעות בדיקות מכניות מפוברק מקו דיג הובילו שונות מסוימת בתגובה התנהגותית2,6,16,17. מספר גורמים עשויים להסביר זאת. ראשית, מכיוון שהלחץ הוא המשתנה החשוב, ההבעה של קצה הסיב כך שהוא מעוגל ואין לו קצוות חדים היא קריטית. שנית, דיווח על ערכי לחץ ולא רק כוח חשוב לשחזור הניסויים, מכיוון שבדיקות מכניות שונות המייצרות כוחות דומים יכולות לעורר לחצים שונים4. שלישית, חיוני ליישם רק גירוי מכני אחד לכל זחל באמצעות בדיקות רעילות, מכיוון שבדיקות כאלה מייצרות נזק לרקמות תלויות מינון ברמות האפידרמיס4 והנוירונים החושיים (איור 2E). גירוי מכני רעיל שני או עוקב, לאחר נזק לרקמות כבר המושרה, יכול לפגוע בתפקוד של נוירונים חושיים היקפיים מושפעים לעורר תגובה התנהגותית שונה. במחקר אחר, זחלים מגורה פעמיים עם בדיקות מכניות רעילות הציגו בעיקר תגובה התנהגותיתמשופרת 5, מה שמרמז על התפתחות של רגישות מכנית חריפה (hyperalgesia), אשר עשוי לנבוע נזק לרקמות עורר על ידי הגירוי המכני המזיק הראשון. לעומת זאת, מחברים אחרים 6 דיווחו עלתגובה התנהגותית מעורבת (מוגברת או מופחתת), המצביעה על כך שהתגובה ההתנהגותית שהשתנתה יכולה להיות בגלל נזק/תפקוד לקוי של הרקמה העצבית. גירוי כל זחל רק פעם אחת מבטל שונות אפשרית בתגובות התנהגותיות הנובעות רגישות או נזק לרקמות. רביעית, אנו מגרים מכנית קטע A8, שהוא אחורי יותר מאשר מחקרים קודמים (אזורים מועדפים A3-A4)2,5,16. בדיקות בין ~ 3,900 kPa ו 5,300 kPa להחיל על כל קטע A2 או A8 לא הראה שום הבדלים התנהגותיים4. בנוסף, A8, לעומת A2-A4, קל יותר לעורר עם בדיקות מכניות המייצרות לחצים נמוכים יותר (<300 kPa) כי הזחל הוא דק יותר באזור זה ולכן בקלות רבה יותר דחוס. מחקרים אחרים הראו כי גירוי מכני רעיל של הקצה האחורי של הזחל (מועבר על ידי סיכת חרקים נוקשה, מוחזק עם מלקחיים) עורר בעיקר קטר קדמי, ולא תגובה מרתיעה או מתגלגלת18. תגובה התנהגותית שונה זו יכולה להיות בשל הבדלים במאפיינים של החומרים המשומשים (חוטי ניטינול ניתנים לכיפוף לעומת סיכת חרקים בלתי דחוסה) או ללחצים שונים המועברים לזחלים (ערך הלחץ של סיכת החרקים לא דווח).
הפיתוח של מבחני nociception מכני עבור זחלים Drosophila אפשרה לשדה לגלות כי ערוצי יון חושיים מכניים שונים ומעגלים עצביים לתווך nociception מכני5,6,16,17. עם זאת, המחקר של רגישות יתר מכנית (allodynia ו hyperalgesia) פיגר, לעומת רגישות של אופני החושים האחרים - חום7, 8,10,13,14, קר9, ו כימי3. השהיה זו עשויה לנבוע בחלקה מהיעדר בדיקות מכאניות מתאימות שיכולות ליצור טווח תגובה מלא המשתרע על פני תת-אחיזה ללחצים suprathreshold. חשיבות מיוחדת, במיוחד להערכת allodynia מכני, הם בדיקות subthreshold שאינם מעוררים תגובה מתגלגלת מרתיעה מזחלים לא נפגעים. המשמעות של הבדיקות המכניות המשופרות שלנו היא שניתן לפברק אותן כדי להתפרס על פני גירויים בלתי מזיקים (subthreshold ~ 174 kPa–200 kPa) או את הטווח הנמוך עד רעיל גבוה (suprathreshold ~ 225 kPa כדי ~ 5,116 kPa). כאן, אנו מדגימים באמצעות חוטים דמויי nitinol פון פריי כי זחלים Drosophila לפתח הן allodynia מכני היפרלגזיה מכני לאחר הקרנת UV. הרגישות המכנית מראה כמה הבדלים בהשוואה לרגישות תרמית. הן תחילתה והן שיא הרגישות המכנית מוקדם יותר (~ 4 שעות) בהשוואה לרגישות תרמית (חום) (~ 8 שעות להיפרלגזיה ו ~ 24 שעות לאגודיניה)7. בנוסף, allodynia מכני hyperalgesia הם בו זמנית (שניהם שיא ב ~ 4 שעות). יתר על כן, בעוד רגישות חום (allodynia ו hyperalgesia) פותר לחלוטין בנקודות זמן מאוחר יותר7, רגישות יתר מכנית הציג זנב ארוך שנשאר מעט מעל קו הבסיס. רגישות קרה בדרוזופילה כרוכה במתג בהתנהגויות מעוררות קור 9 ובהופעתן שלהתנהגויות חדשות מעוררות קור – תופעה שאינה נצפית בגירוי מכני. הבדלים אלה בהתנהגויות התפרצות, משך זמן ונצפות מצביעים על כך שכל שיטה חושית עשויה להיות נשלטת על ידי מסלולי איתות שונים. שילוב מבחני הרגישות המתוארים כאן עם הכלים הגנטיים החזקים הזמינים בדרוסופילה אמור לאפשר ניתוח גנטי מדויק של רגישות יתר מכנית (allodynia ו hyperalgesia) שנצפו.

זחלי דרוזופילה מפגינים התנהגות מתגלגלת מרתיעה אופיינית כאשר נחשפים לגירויים רעילים שונים: תרמי1, מכני2, וכימיקל3. התנהגות זו נבדלת בבירור מתנועה רגילה. כאן אנו מתארים מבחנים מכניים משופרים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך nociception מכני ורגישות מכנית.
במחקר שנערך לאחרונה, המצאנו חוטים דמויי פון פריי באמצעות חוטי ניטינול4. בדיקות המפעילות כוחות ולחצים שונים נעשו על ידי שינוי האורכים והקוטרים של חוטי הניטינול היוצרים כל גשוש. בדיקות מכניות כוילו וערכי הכוח הנמדדים (במילינוטון, mN) הוסבו ללחץ (קילופסקל, kPa), בהתבסס על אזור הקצה של כל בדיקה4. ייצור מותאם אישית של בדיקות מכניות מותר לנו ליצור subthreshold (≤200 kPa) כדי suprathreshold (225 kPa כדי 5318 kPa) לחצים, אשר יכול, באופן עקרוני, להיות מועיל לחקר רגישות יתר מכנית. באמצעות חוטים אלה פון פריי מכני משופר, הראינו כי לחץ4, בניגוד לכוח נבדק בעבר2,5,6 בקורלציה עקבית יותר עם היענות התנהגותית מרתיעה בזחלים Drosophila. בדיקה מכנית משופרת המתוארת כאן גם עזר לזהות גורם גדילה אנדותל כלי דם שמורות (VEGF) הקשורות קולטן טירוסין קינאז איתות מסלול המסדיר nociception מכני זבובים וחולדות4.
אלודיניה מכנית והיפרלגזיה, שתי אופנים של רגישות יתר, הם understudied יחסית בזחלים Drosophila, לעומת תרמית (חום וקור) ואמצעים חושיים כימיים3,7,8,9,10. זה כנראה בשל היעדר בדיקות מכניות ספציפיות המשתרעות מגירויים מזיקים לטווח רעיל גבוה2,5,6. גירוי בלתי מזיק בדרך כלל המעורר את התנהגות מתגלגל מרתיע טיפוסי לאחר זחלים Drosophila לחוות נזק לרקמות3,7 נקרא allodynia. תגובה מתגלגלת מוגזמת לגירוי רעיל בדרך כלל ידועה בשם hyperalgesia7. גירויים רעילים מוגדרים ככאלה שמעוררים נזק לרקמות ויכולים להפעיל nociceptors11. גירויים רעילים המועברים לזחלי דרוזופילה פוגעים באפידרמיס המחסום, בנוירונים החושיים ההיקפיים3,4,7, או שניהם.
במאמר זה, אנו מדגימים כיצד לפברק ולכייל בהתאמה אישית בדיקות מכניות דמויי פון פריי המתאימות לזחלים של דרוזופילה. יתר על כן, אנו מראים כיצד להשתמש בבדיקות אלה כדי לבדוק תגובות נוציפציביות מכניות בזחלי דרוזופילה. לבסוף, אנו מדגימים עוד יותר את התועלת של בדיקות אלה באמצעות אותם כדי להדגים את נוכחותם של רגישות יתר מכנית, הן allodynia והן hyperalgesia, בעקבות נזק לרקמות בזחלים Drosophila (ראה תוצאות מייצגות).

<table><tbody><tr><td>Beaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540C</td><td>Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do.</td></tr><tr><td>Black (Arkansas) bench stone</td><td>Dan&amp;rsquo;s Whetstone</td><td>SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C</td><td>Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td>Any equivalent confocal microscope will do</td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-816</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816</td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-500</td><td>For anesthetizing larvae.</td></tr><tr><td>Etherization chamber</td><td></td><td></td><td>This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape.</td></tr><tr><td>Fiber Optic Light Guide</td><td>Schott AG</td><td>A08575</td><td>Schott Dual Gooseneck 23 inch</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tool</td><td>FS-1670</td><td>For transferring larvae</td></tr><tr><td>Glue</td><td>Aleene&#039;s</td><td>N/A</td><td>Aleene&#039;s&amp;reg; Wood Glue, formerly called (Aleene&#039;s All-Purpose Wood Glue)&lt;br/&gt; https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue</td></tr><tr><td>Graspable holder</td><td>Loew Cornell</td><td>N/A</td><td>Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces.</td></tr><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma</td><td>H8898-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic needle 30G 1/2&quot;L</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1471286</td><td>BD Precisionglide&amp;reg; syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires</td></tr><tr><td>Large Petridish</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td>60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish</td></tr><tr><td>Microscope (Zeiss) Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>NT55-605</td><td>Any equivalent microscope will do</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass 22x22</td><td>Fisher</td><td>12-545-B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass 22x40</td><td>Corning</td><td>2980-224</td><td>Tickness 1 1/2</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Globe Scientific Inc.</td><td>1358Y</td><td></td></tr><tr><td>Mini Diagonal Cutter</td><td>Fisher Scientific</td><td>S43981</td><td>For cutting nitinol filaments</td></tr><tr><td>Nitinol filaments, Diameters: 0.004&amp;rdquo;, 0.006&amp;rdquo;, 0.008&amp;rdquo;</td><td>Mailin Co</td><td>N/A</td><td>Fifteen pieces of each diameter of 12&amp;rdquo; length were ordered.&lt;br/&gt; https://malinco.com/</td></tr><tr><td>Piece of black vinyl</td><td>Office Depot</td><td>N/A</td><td>We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva</td></tr><tr><td>Small Petridish</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td>35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td>Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish</td></tr><tr><td>Wipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;W&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3605</td><td>Control strain for behavioral assays</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;ppk-Gal4&gt;UAS-mCD8-GFP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>8749</td><td>Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons</td></tr></tbody></table>

an improved assay and tools for measuring mechanical nociception in drosophila larvae

מבחנים שפורסמו עבור nociception מכני ב Drosophila הובילו הערכות משתנות של התנהגות. כאן, אנחנו מפוברק, לשימוש עם זחלים Drosophila, מותאם אישית ניקל טיטניום סגסוגת (ניטינול) חוטים. בדיקות מכאניות אלה דומות לסיבים של פון פריי המשמשים בעלי חוליות למדידת תפיסה מכנית. כאן, אנו מדגימים כיצד להפוך ולכייל בדיקות מכניות אלה וכיצד ליצור מינון התנהגותי מלא-תגובה מ subthreshold (טווח מזיק או רעיל) כדי suprathreshold (טווח רעיל נמוך עד גבוה) גירויים. כדי להדגים את התועלת של הבדיקות, חקרנו רגישות יתר הנגרמת על ידי נזק לרקמות בזחלי דרוזופילה. אלודיניה מכנית (רגישות יתר לגירוי מכני בלתי מזיק בדרך כלל) והיפרלגזיה (היענות מוגזמת לגירוי מכני רעיל) עדיין לא הוקמו בזחלים דרוזופילה. באמצעות בדיקות מכניות כי הם בדרך כלל מזיקים או בדיקות כי בדרך כלל לעורר התנהגות מרתיעה, מצאנו כי זחלים Drosophila לפתח רגישות יתר מכנית (הן allodynia ו hyperalgesia) לאחר נזק לרקמות. לפיכך, הבדיקות המכניות והבדיקות שאנו ממחישים כאן יהיו ככל הנראה כלים חשובים לנתח את המנגנונים המולקולריים/גנטיים הבסיסיים של רגישות יתר מכנית.

פיתחנו גשושיות מכניות מותאמות אישית, תוך שימוש בצינור ניטינול(איור 1A,N),כדי לעורר התנהגויות מעוררות מכנית ויצרנו עקומת תגובה מלאה של מינון התנהגותי באמצעות בדיקות מכניות בלתי מזיקות ומזיקות בעוצמה משתנה(איור 2D)המוכיחות כי ניתן להשתמש בבדיקות אלה כדי ללמוד את הבסיס (בהיעדר פציעה) תפיסה מכנית.
תוצאות הבדיקה ההתנהגותית שלנו קבעו כי בדיקות המפעילות לחצים מתחת ל- 200 kPa (~ 1.57 mN) (איור 1M), כאשר הן מוחלות על זחלי דרוסופילה, אינן מעוררות תגובת גלגול מרתיעה (איור 2D ו- Video 3). כצפוי, בדיקות מכניות תת-קרקעיות או לא רעילות אלה (175 kPa או 200 kPa) לא עוררו נזק לרקמות עצביות נראות לעין (איור 2E). בגלל שהם לא לגרום נזק, בדיקות כאלה יכול להיות שימושי כדי להעריך allodynia מכני (רגישות יתר לגירויים מכניים שאינם רעילים בדרך כלל). לעומת זאת, בדיקות suprathreshold או רעילות (מ 462 kPa ל 5,116 kPa), עורר תגובה התנהגותית מוגברת (איור 2D) באופן תלוי מינון - עם לחצים גבוהים יותר לעורר תגובות התנהגותיות חזקות יותר. כצפוי, לחץ מכני suprathreshold גם גרם נזק לרקמות תלויות מינון לנוירונים החושיים ההיקפיים עצמם (איור 2E). האזור הנמדד של נזק לרקמות (בμm2 ± סטיית תקן) שנלקח מארבעה זחלים לכל קבוצה היו: 2,051.03 ± 703.81 (462 kPa), 5,102 29 ± 1,004.67 (2,283 kPa) ו- 12,238.83 ± 3,724.11 (5,116 kPa). לפיכך, לחצים הגדולים או שווים ל- 462 kPa (~ 63 mN), המעוררים תגובת גלגול מרתיעה (ב-25% או יותר מהזחלים) וגורמים לנזק לרקמות עצביות גלויות (איור 2E), עשויים להיות מתאימים לחקר היפרלגזיה מכנית (רגישות יתר לגירויים מכניים מזיקים בדרך כלל). בדיקות מכניות Nociceptive (≥462 kPa) תמיד לגרום נזק לרקמות (n = 10, מוערך באופן איכותי) אבל לא תמיד לעורר תגובה מתגלגלת מרתיעה.
כדי להעריך רגישות יתר מכנית (allodynia ו hyperalgesia), השתמשנו במודל זחל Drosophila מבוסס היטב של רגישות nociceptive המשתמשת אור אולטרה סגול (UV) הקרנה כדי לגרום נזק לרקמות7,12. בדיקה זו סייעה לנתח את המנגנונים הגנטיים והתאיים של רגישות יתר תרמית8,9,10,13,14,15. כדי לקבוע אם טיפול UV גורם allodynia מכני, באמצע השלישי כוכב שליטה (w1118)זחלים היו מוקרן מדומה או UV מוקרן (15-20 mJ / cm2) (איור 3A). לאחר מכן, הזחלים נבדקו באופן התנהגותי ב 2 שעות, 4 שעות, 8 שעות, 16 שעות, ו 24 שעות לאחר הטיפול עם בדיקה מכנית subthreshold בדרך כלל (200 kPa, 1.57 mN). כ-20% מהזחלים הגיבו כבר ב-2 שעות לאחר טיפול UV, בעוד ש-50% השיבו ב-4 שעות, לעומת 6.6% ו-8.3% בעלי חיים מדומים מוקרנים ב-UV, בהתאמה (איור 3B). זה מציין כי נזק לרקמות הנגרמת על ידי UV גורם allodynia מכני ב 4 שעות לאחר הקרנה. בנקודות זמן מאוחרות יותר (8 שעות, 16 שעות, ו 24 שעות) התגובה ההתנהגותית של הזחלים שטופלו UV היה בטווח של 16%-20% מגיבים (ממוצע של n = 3-6 סטים של 10 זחלים כל אחד), גדל מעט (אבל לא מובהק סטטיסטית) לעומת קבוצת הביקורת מדומה מוקרן (בטווח של 3%-6% של המגיבים, ממוצע ממוצע של n = 3-6 קבוצות של זחלים כל אחד) (איור 3B).
כדי לחקור היפרלגזיה מכנית, נעשה שימוש בלחץ suprathreshold (462 kPa, 3.63 mN), שבדרך כלל גורם לתגובה מתגלגלת מרתיעה בכ-20% מהזחלים (איור 2D)וגורם לנזק עצבי לרקמות העצביות (איור 2E). מרחנו את הגשושית 462 kPa על הצד הגבי של הזחלים עם או בלי נזק לרקמות הנגרמות על ידי UV(איור 3A). מצאנו כי זחלים נבדקו ב 4 שעות, 8 שעות, ו 16 שעות לאחר טיפול UV הראו עלייה משמעותית בתגובה מתגלגל מרתיעה, עם 4 שעות להיות השיא של רגישות יתר התנהגותית (~ 60% מגיב); בעלי חיים מדומים מוקרנים UV הראו ~ 27% של תגובה מרתיעה (איור 3C). בדומה לאגודיניה מכנית, התגובה ההתנהגותית ב 8 שעות, 16 שעות, ו 24 שעות של בעלי חיים שטופלו UV (בטווח של 36%-42%) מבחינה סטטיסטית לא ניתן היה להבחין בין הזחלים שאינם מטופלים (בטווח של 20%-26%). הזחלים בשלב ה-instar השלישי המאוחר אכן הראו ירידה קלה בתגובה ההתנהגותית הבסיסית בהשוואה לשלב ה-instar השלישי האמצעי. אנו משערים שזה יכול להיות גם על ידי גודל מוגבר של הזחלים (איור 2A) או עובי מוגבר של הקוטיקל המכסה את הגוף. עובדה זו יכולה להסביר מדוע בשלב מאוחר יותר של הפיתוח הטיפול UV אינו גורם רגישות מכנית גדולה יותר, כפי שנצפה 4 שעות לאחר טיפול UV.
יחד, התוצאות שלנו מצביעות על כך זחלים Drosophila לפתח הן אלודיניה מכנית hyperalgesia מכני בעקבות נזק לרקמות הנגרמת על ידי UV. זמן השיא של allodynia מכני hyperalgesia זהה, 4 שעות לאחר טיפול UV; עם זאת, hyperalgesia מכני יש זנב זמני בולט יותר כפי שהוא חוזר לבסיס לאט יותר בהשוואה allodynia מכני.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig01.jpg"> איור 1: פיתוח כלי דמוי פון פריי להערכת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה. (A) תמונה של בדיקה מכנית המשמשת לחקר תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה. (B)חוטי ניטינול וקטריהם היחסיים מוצגים בקנה מידה יחסי. (C)תמונה של חותך התיל האלכסוני המשמש לחיתוך חוטי הניטינול. (ד)החלקת הקצוות החדים של חוט הניטינול החתוך באבן מחדדת. (E)מחט Hypodermic נהג לעשות חור לתוך ידית מקל ארטיק עץ של החללית. קצה המחט צריך להגיע לפחות לחצי מגובה מקל הידית להחדרת חוטים מאובטחת. (F-G) מצורף של חוט הניטינול על ידי הדבקה לתוך ידית מקל ארטיק עץ עם חור הכנסה. (H-L) כיול של בדיקות מכניות על ידי לחיצה עליהם כנגד סולם. (ז)ערכים של כוח (ב- mN) ולחץ (ב kPa) שנוצר על ידי בדיקות מכניות שונות. אורכו של כל חוט ניטינול המשמש לבניית הבדיקות (P1-P10; P: בדיקה) מפורט בסנטימטרים (ס"מ). (N)תמונה של קבוצה שלמה של בדיקות מכניות, החל 174 kPa ל 5,116 kPa. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61911/61911fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig02v2.jpg"> איור 2: מבחני nociception מכניים: חוטים דמויי פון פריי יוצרים עקומת תגובת מינון של התנהגות מתגלגלת מרתיעה וגורמים נזק לרקמות לנוירונים חושיים. (A)תמונות של השלבים השונים (כוכב שני ושלישי) של זחלי דרוזופילה. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ. (B) קריקטורה של הנוף הגבי של הזחל השלישי instar Drosophila. הנקודה האדומה מציינת את קטע הבטן שבו החללית המכנית מוחלת. T: קטע בית החזה; A: קטע בטן. ציוני דרך אנטומיים אחרים מסומנים. (C) קריקטורה של הבדיקה: בדיקה מכנית מוחלת על הצד הגבי של הזחל עד שהוא מתכופף על פני השטח מתחת ולאחר מכן מוחזק במשך 2 s. אם הלחץ גבוה מספיק, זה מעורר תגובה מתגלגלת מרתיעה עם שחרורו. (D) תגובת מינון התנהגותי; כל נקודה כחולה מייצגת את אחוז הזחלים שהגיבו, בגלגול מרתיע, לגירוי המכני בתוך קבוצה של 10 בעלי חיים. עלילת כינור של אחוז התנהגות מתגלגלת מרתיעה הנגרמת על ידי בדיקות מכניות שונות. kPa: קילופסקלים. התוויית תיבות מייצגת חציון (ירוק), שפם (אדום) מייצג את האחוזונים העשירי וה-90. (ה)נזק לרקמות: זחלי כוכב שלישי (של גנוטיפ ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP לתיוג נוירונים חושיים nociceptive) נבדקו בקטע הגב A8 עם הלחצים שצוינו. לאחר מכן נבדקו הנוירונים החושיים DdaC Class IV המסווגים באופן פלואורסצנטי (על פני קו האמצע הגבי) (ראו סעיפים 4 ו-5). אזורים לבנים (כוכביות אדומות) מייצגים פערים או נזק לרקמות. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. בלוח ב', הזחל מוצג בתצוגה הגבית, ואילו ב-C הוא התצוגה לרוחב. בדיקות מכאניות שנלחצו כנגד צד הקוטיקל-אפידרמיס הגבי של הזחל מייצרות כיס דמוי דיכאון בנקודת המגע של קצה הגשוש והסביבה. הקו השחור המוצק המעוקל לכיוון הצד הגחוני הוא החלק העליון של הכיס, ואילו הקו הצדדי האפור המקווקו מייצג את הצד הצדדי ואת תחתית הכיס. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61911/61911fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig03v2.jpg"> איור 3: רגישות יתר מכנית לאחר נזקי UV. (A)סכמטי של העיצוב הניסיוני לבדיקת רגישות. באמצע השלישי כוכב היו מטופלים מדומה (שאינם UV) או UV מוקרן. לאחר מכן בוצעה מבחני nociception מכניים בנקודות זמן שונות (2 שעות, 4 שעות, 8 שעות, 16 שעות ו-24 שעות) לאחר טיפול מדומה או הקרנה. (ב) אלודיניה מכנית: אחוז הזחלים המציגים גלגול מרתיע לאחר בדיקה עם גירוי מכני תת-קרקעי או לא רעיל בדרך כלל (200 kPa, 1.57 mN) בנקודות הזמן שצוינו לאחר טיפול מדומה או הקרנת UV. (ג)היפרלגזיה מכנית: אחוז הזחלים המציגים גלגול מרתיע לאחר חיטוט עם suprathreshold בדרך כלל או גירוי מכני רעיל (462 kPa, 3.63 mN) בנקודות הזמן המצוין לאחר טיפול מדומה או הקרנת UV. קווי שגיאה מציינים ממוצע +/- SEM. נעשה שימוש בבדיקת tדו-זנבית לניתוח סטטיסטי: *p < 0.05, **p < 0.01; ns: לא משמעותי. כל נקודה אדומה, בחלוניות B ו- C, מייצגת את היחס הממוצע של 10 זחלים, n = 3-6 סטים לכל נקודת זמן/תנאי. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61911/61911fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
וידאו 1: תנועה רגילה של זחלי דרוזופילה. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61911/Video_1_regresolu.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
וידאו 2: גירוי מכני רעיל של זחלי דרוזופילה. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61911/Video_2_regresol.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
וידאו 3: גירוי מכני subthreshold של זחלים Drosophila. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61911/Video_3_Subthreshold_short.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae at JoVE.com

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

מטרת פרוטוקול זה היא להראות כיצד לבצע בדיקה משופרת עבור nociception מכני בזחלים Drosophila. אנו משתמשים בהסמכה כאן כדי להדגים כי רגישות יתר מכנית (allodynia והיפרלגזיה) קיימת בזחלים דרוזופילה.

מבחנים וכלים משופרים למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

an-improved-assay-tools-for-measuring-mechanical-nociception

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Behavior

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

4.7K Views.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center. מטרת פרוטוקול זה היא להראות כיצד לבצע בדיקה משופרת עבור nociception מכני בזחלים Drosophila. אנו משתמשים בהסמכה כאן כדי להדגים כי רגישות יתר מכנית (allodynia והיפרלגזיה) קיימת בזחלים דרוזופילה.

Video: An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Biology

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Bioengineering

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; רימה

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Neuroscience

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Immunology and Infection

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain perception in rodents. Withdrawal thresholds can be measured first at baseline and then following drug, venom, injury, allergen,&#160;or otherwise evoked inflammation by applying an accurate force on very specific areas of the skin. An electronic von Frey apparatus allows precise assessment of mouse hind paw withdrawal thresholds that are not limited by the available filament sizes in contrast to classical von Frey measurements. The ease and rapidity of measurements allow for incorporation of assessment of tactile sensitivity outcomes in diverse models of rapid-onset inflammatory and neuropathic pain as multiple measurements can be taken within a short time period. Experimental measurements for individual rodent subjects can be internally controlled against individual baseline responses and exclusion criteria easily established to standardize baseline responses within and across experimental groups. Thus, measurements using an electronic von Frey apparatus represent a useful modification of the well-established classical von Frey filament-based assays for rodent mechanical allodynia that may also be applied to other nonhuman mammalian models.

Electronic von Frey measurements are an effective and improved alternative to classical von Frey filaments, as they allow rapid and precise measurement of changes in rodent mechanical withdrawal thresholds to continuously applied pressure stimuli before and after an inflammatory event.

מדידת שינויים במגע רגישות בכף הרגל האחורית של עכברים באמצעות מנגנון אלקטרוני פון פריי

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

התנהגות Assay עבור Mechanosensation של MARCM מבוסס משובט ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

הסרה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח Immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; נוירון מוטון ניוון

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Local Heat Probe Assay: A Method to Assess Nociception of High Temperatures in Drosophila Larvae

Source: Chattopadhyay, A., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/3837/" target="_blank">Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2012).
Drosophila larvae have dedicated sensory neurons&#8211;nociceptors&#8211;whose response to potentially harmful thermal stimuli triggers aversive&#8211;or so-called &#34;nocifensive&#34;&#8211;behaviors in the animal. This video describes a method to assess thermal nociception by recording larval behavior in response to local application of a heat probe onto the cuticle. This method is, therefore, called the local heat probe assay.

בדיקת חום מקומית: שיטה להערכת נוסיספטציה של טמפרטורות גבוהות בזחלי דרוזופילה

Source: Chattopadhyay, A., et al. Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2012).
Drosophila larvae ...

מבחנים וכלים משופרים למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב

שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

מדידת שינויים במגע רגישות בכף הרגל האחורית של עכברים באמצעות מנגנון אלקטרוני פון פריי

התנהגות Assay עבור Mechanosensation של MARCM מבוסס משובט ב

הסרה של

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב

פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד

בדיקת חום מקומית: שיטה להערכת נוסיספטציה של טמפרטורות גבוהות בזחלי דרוזופילה