نشكر توماس وانغ على تطوير النموذج الأولي لخيوط فون فراي، وباتريك جيه هوانغ لتحسين مقايسة المسبار الميكانيكي، ومركز بلومينغتون دروسوفيليا للأسهم للسيطرة(ث1118) وppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP الأسهم تطير، وأعضاء مختبر غالكو لقراءة نقدية المخطوطة. وقد دعم هذا العمل R21NS087360 وR35GM126929 إلى MJG.

1. بناء مسبار الميكانيكية
<ol><li>قطع كل خيوط النيتينول (الشكل 1B)، عمودي على محورها الطويل، إلى الطول المحدد (الشكل 1M-N) باستخدام قاطع أسلاك صغير (الشكل 1C). خيوط تأتي في ثلاثة أقطار محددة مسبقا مختلفة (الشكل 1B). ملاحظة: الأطوال المحددة هنا هي دليل لتحقيق الضغوط التقريبية المشار إليها، وذلك باستخدام بروتوكول مماثل لبناء جبل. في نهاية المطاف، بغض النظر عن طول قطع خيوط، وعمق الثقب في جبل، يجب أن تقاس خيوط / معايرة على التوازن للحصول على قوة بالضبط / قيمة الضغط.</li>
	<li>فحص طرف خيوط تحت منظار مجسم لضمان عدم وجود حواف حادة أو غير منتظمة حيث يمكن أن تسبب هذه الخيوط تلفًا في الأنسجة لبشرة اليرقات وتتداخل مع المعايرة.</li>
	<li>يدويا سلاسة الحواف الحادة للمسبار الميكانيكي باستخدام حجر شحذ حتى لا تستمر أي مخالفات حادة(الشكل 1D).</li>
	<li>جعل حفرة قرب نهاية عصا الملوثات الخشبية الخشبية (الشكل 1E) باستخدام إبرة تحت الجلد (انظر جدول المواد). أدخل الإبرة على الأقل في منتصف الطريق من خلال ارتفاع عصا popsicle (الشكل 1E). هذا يخلق غرفة لإدراج خيوط النيتينول.</li>
	<li>تطبيق الغراء الخشب على خيوط نيتينول واحد (الشكل 1F) وإدراج خيوط الغراء المغلفة في فتحة إبرة في عصا الملوثات الخشبية الخشبية (الشكل 1G). السماح لتجف ل~ 5 ساعة.</li>
	<li>معايرة كل مسبار ميكانيكي عن طريق الضغط عليه ضد مقياس حتى ينحني المسبار الميكانيكي (الشكل 1H-L). هذه هي نقطة القوة القصوى التي يمكن تسجيلها في غرام. اعتمادا على أقطار خيوط (قبل تعيين) وأطوال (يحددها المستخدم) يمكن توليد مجموعة كاملة من القوى والضغوط.</li>
	<li>تحويل الكتلة المسجلة في الخطوة 1.6 إلى قوة في الميلينوتون (mN) باستخدام الصيغة f = ma (القوة تساوي الكتلة مضروبة في تسارع الجاذبية). (و): القوة؛ م: كتلة; أ: تسارع الجاذبية (9.8 م / ث2) (الشكل 1M).</li>
	<li>وأخيراً، قم بتحويل القوة المحسوبة إلى ضغط (قوة/منطقة) بالكيلوباسكال (كيلو باسكال) عن طريق تقسيم القوة المقاسة على مساحة سطح طرف خيوط (الشكل 1M). لحساب المنطقة، قم بتحويل قطر خيوط النيتينول المختلفة من بوصات (0.04"، 0.06 بوصة، و0.08 بوصة) إلى سنتيمتر. ثم يحدد πr2 (حيث، ص = نصف قطر خيوط النيتينول) المنطقة (انظر الشكل 1M). إعداد مسابير متعددة باستخدام خيوط من أقطار وأطوال مختلفة سوف تولد مجموعة كاملة تمتد على نطاق استجابة ليرقات دروسوفيليا (مجموعة عينة هو مبين في الشكل 1N). ملاحظة: تحقق من كل مسبار ميكانيكي كل 3-4 أسابيع على الأقل. عندما ينحرف الضغط بأكثر من ± 3٪ من المقياس الأصلي، يجب أن يكون مسبار ميكانيكي جديد ملفقاً.</li>
</ol>2- إعداد اليرقات
<ol><li>رفع سلالة التحكم (ث1118) ذرية اليرقات أو اليرقات التي تحتوي على transgenes ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP (لتصور الضرر للخلايا العصبية الحسية) على الغذاء القياسي في حاضنة 25 درجة مئوية. عادة، يتم الاحتفاظ بالمخزونات بشكل روتيني عند 18 درجة مئوية ولكن يتم تربية كلا الوالدين وذرة اليرقات عند 25 درجة مئوية على الغذاء القياسي دقيق الذرة للتجارب. ملاحظة: الذباب البالغ (خمسة ذكور وعشرة الإناث، 1:2 نسبة) يتم الاحتفاظ بها في قارورة الذبابة، للسماح زرع البيض، لحوالي 24 ساعة. يبدأ الوقت بعد وضع البيض (AEL) من عند إزالة البالغين.</li>
	<li>جمع اليرقات الثالثة، بعد ما يقرب من 96 ساعة من وضع البيض، عن طريق رش بلطف ماء الصنبور في الطعام ذبابة لينة تحتوي على اليرقات. اليرقات الهائمة التي تركت الطعام ، أو التي تم قذفها في الأبراج الأمامية أو الخلفية ، كبيرة جدًا / قديمة جدًا لهذا الفحص. اليرقات الثانية (~ أقل من 4 مم في الطول) صغيرة جدا.</li>
	<li>صب محتويات الطعام ذبابة لينة في معيار نظيفة حجم طبق بيتري (100 مم × 15 ملم).</li>
	<li>باستخدام ملقط، فرز منتصف الثالث إنستار، متوسطة الحجم، اليرقات (انظر الشكل 2A) من أصغر (الثانية فيستار والثالث في وقت مبكر instar) أو أكبر (أواخر أو تجول الثالث فيستار) يرقات. ينصح بالتلاعب اللطيف بالملباب لتجنب أي تلف في الأنسجة لليرقات. ملاحظة: يستند النقل باستخدام ملقط في الغالب على توتر المياه وليس عن طريق الضغط على اليرقات مع ريش من ملقط. بديل لاستخدام ملقط للمناورة اليرقات هو فرش الطلاء الناعمة. مع أي من الاداة، يجب على المستخدم ممارسة نقل الحيوانات، حتى لا يسبب تلف الأنسجة غير مقصودة التي يمكن أن تعقد القياسات السلوكية.</li>
	<li>نقل اليرقات الثالثة المتوسطة، باستخدام ملقط، إلى طبق بيتري صغير (30 مم × 15 ملم) يحتوي على القابس صغير من الطعام المتطاير مبلل بالماء في درجة حرارة الغرفة. إبقاء اليرقات في طبق بيتري الصغيرة حتى يتم إجراء التجارب، ولكن ليس أكثر من 20 دقيقة. ملاحظة: عموما، نقل 20-30 اليرقات إلى المكونات الغذائية سوف تعطي عددا كافيا لمدة 20 دقيقة من الخضوع للتشهين السلوكي.</li>
</ol>3. الميكانيكية nociception فحص
<ol><li>ضع يرقة متوسطة الثالثة (باستخدام ملقط) على لوحة رقيقة من الفينيل الأسود أو الداكن تحت مجسم مجسم حقل مشرق. يوفر اللون الداكن التباين الذي يحسن التصور من اليرقة. من الأفضل أن يكون لديك قطعة منقولة بحرية من الفينيل الداكن لأنه يسمح للمستخدم بمحاذاة اليرقة دون لمسها أو إيذائها.</li>
	<li>وضع أضواء الألياف الضوئية بين العدسات الهدف المجهر ومنصة الفينيل الأسود أو الداكن; وهذا سيسمح كافية عالية التباين الإضاءة لرؤية اليرقة.</li>
	<li>تخلص من اليرقات التي لا تظهر الحركة العادية بعد نقلها إلى الوسادة. يمكن أن تتداخل هذه مع الاستجابة السلوكية الناوسيبية العادية. للاطلاع على الحركة العادية، راجع الفيديو 1.</li>
	<li>امسح، باستخدام منشفة ورقية، أي مياه زائدة تحيط باليرقة قد تتسبب في تعويم اليرقة على وسادة الفينيل.</li>
	<li>توجيه اليرقة عن طريق تحريك لوحة الفينيل الداكنة. يجب أن يشير رأس / فم اليرقة إلى اليسار إذا كنت اليد اليمنى والعكس بالعكس إذا كنت أعسر(الشكل 2A -B).</li>
	<li>تطبيق المسبار الميكانيكي المختار، عادة لمدة 1-2 s، على الجانب الظهري الخلفي من اليرقة في الجزء البطني تقريبا A8 (انظر الشكل 2B)،حتى ينحني المسبار وينتزع كمية الضغط التي تم قياسها سابقا (الشكل 2C). من المهم أن يضغط المسبار على السطح الظهري لليرقة ويضغط اليرقات في الوسادة الأساسية عند نقطة ملامسة المسبار. ملاحظة: عند نقطة التماس بين طرف خيوط النيتينول وبشرة الظهرية، تحقيقات أقل من 2300 كيلو باسكال، تنحني بشكل رئيسي دون اختراق الأنسجة الجلدية والأنسجة الأساسية. هذه المسابير نادرا ما تؤثر على وفيات اليرقات4. في ضغوط أعلى (>5000 كيلو باسكال) تحقيقات على حد سواء الانحناء و, أحيانا, اختراق الأنسجة التي كانت تحتها. يؤدي ثقب اليرقات إلى إعاقة بقاءاليرقات 4، وإذا لوحظ ذلك، يتم التخلص من هذه اليرقات عادة من التحليل السلوكي.</li>
	<li>سجل الاستجابة السلوكية لكل يرقة. يشار إلى استجابة إيجابية نُفُسّة(فيديو 2)إذا كانت اليرقة تظهر لفة كاملة من 360 درجة على طول محور جسمها في غضون 3 s. تعتبر الردود الأخرى (محاولة تشغيل، تتبع الارتباطات السريعة، وتلوّه) سلبية لأغراض هذا الفحص. ملاحظة: اليرقات حفزت مع التحفيز الميكانيكية subthreshold (200 كيلو باسكال) لم تثر استجابة نموذجية nociceptive أو المتداول(فيديو 3). بعض اليرقات لم تظهر ردود سريعة إلى الأمام أو لمسة خفيفة مثل التغييرات في اتجاه الحركة.</li>
	<li>تخلص من اليرقة واحضر اليرقة التالية للتشايس ، وتكرار الخطوات من 3.1 إلى 3.7.</li>
	<li>كرر الخطوات 3.1-3.7 حتى يتم الوصول إلى العدد المطلوب من اليرقات (ثلاث إلى ست مجموعات من ن = 10 يرقات استخدمت هنا لكل مسبار). ملاحظة: عند استخدام مسابير ميكانيكية ضغط أقل (174-462 كيلو باسكال)، فإن الفحص يستغرق وقتاً أكثر لكل يرقة. وذلك لأن غيض من خيوط أطول يتذبذب أكثر، مما يجعل من الصعب كزة اليرقة في وسط الجزء A8. الممارسة ضرورية مع هذه التحقيقات.</li>
</ol>4. المجهر Confocal لتقييم مورفولوجيا الخلايا العصبية
<ol><li>ضع يرقة (من النمط الجيني ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP لتسمية الخلايا العصبية الحسية) التي تم تحفيزها سابقًا بخيوط نيتينول في غرفة أثير داخل جرة كوبلين تحتوي على كوبر 10 مل يحمل كرة قطنية غارقة في ~ 1 مل من الأثير الديثيل. دع اليرقة تجلس في الغرفة لمدة 5 دقائق تقريبًا. ملاحظة: يتم توفير بروتوكول مفصل لـ etherization في دراسة سابقة نشرتها مجموعتنا12.</li>
	<li>شطف اليرقة بلطف من غرفة الإيثيري في طبق بيتري صغير.</li>
	<li>وقد الجاهزة شريحة مجهر واحد، واثنين من الأغطية الصغيرة (22 × 22 ملم)، و coverlip واحد طويل (22 × 54 ملم) (انظر جدول المواد).</li>
	<li>إضافة قطرات صغيرة من الأثير : حل النفط (1:5 نسبة الايثيل الأثير إلى حل زيت الهالوكربون ، انظر جدول المواد) إلى طرفي الشريحة ، ثم ضع الأغطية الصغيرة على رأس قطرات صغيرة. يخلق هذا الترتيب فجوة صغيرة في المساحة حيث يمكن أن تناسب اليرقة. ملاحظة: اضغط على الأغطية الصغيرة مقابل شريحة المجهر حتى يصبح من الصعب الانزلاق.</li>
	<li>إضافة بعض قطرات من الأثير: حل النفط في منتصف الشريحة المجهر ومن ثم وضع اليرقة، وذلك باستخدام ملقط، على مركز الشريحة المجهر (بين الأغطية الصغيرة). تأكد من أن المحور الأمامي لليرقة موازٍ للجانب القصير من الشريحة وأن الجانب الظهري يواجه لأعلى.</li>
	<li>غطي اليرقات مع غطاء طويل يوضع فوق اليرقة واثنين من الأغطية الصغيرة. ملاحظة: اضغط بسخاء على الأغطية الطويلة حتى تصبح اليرقة مسطحة تقريبًا.</li>
	<li>صورة الجزء A8 من اليرقة باستخدام مجهر confocal (انظر جدول المواد)باستخدام طول موجة الليزر 488 (GFP). ملاحظة: صورة اليرقة على الفور لأن التخدير عبر الأثير سوف تتلاشى بسرعة (~ 5-10 دقيقة) وسوف تستيقظ اليرقة وتتحرك، مما سيعقد التصوير أكثر.</li>
	<li>التقاط الصور Z-المكدس في قرار من 1024 × 1024 بكسل باستخدام فتحة رقمية 20x (NA) 0.7 عدسة الهدف الجاف في 1x التكبير، حجم الخطوة من 1.5 μm.</li>
</ol>5. كمية تلف الأنسجة
<ol><li>جمع وتحويل الصور المكدسة سلسلة Z، من القسم 4.8، إلى إسقاط Z واحد (تسطيح صور متعددة مأخوذة في مختلف المستويات البؤرية في صورة مركبة واحدة). ويمكن تنفيذ ذلك باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا (مثل أوليمبوس فلوفيو) أو أي منصة ما يعادلها من المصادر المفتوحة، مثل فيجي/الصورة J. احفظ الإسقاط الوحيد Z في شكل TIFF.</li>
	<li>افتح برنامج تحليل الصور في فيجي/إيمج.</li>
	<li>انقر فوق ملف، من شريط القوائم، وحدد فتح من النافذة المعروضة.</li>
	<li>حدد إسقاط صورة مفردة مخزنة، محفوظة في تنسيق TIFF، ليتم تحليلها.</li>
	<li>انقر على تحرير، من شريط القوائم، وحدد خيار عكس من النافذة التي يتم عرضها.</li>
	<li>انقر على الصورة، من شريط القوائم، ثم حدد ضبط، من النافذة التي يتم عرضها، وأخيراً حدد خيار السطوع/التباين.</li>
	<li>حدد الخيار شكل حر من شريط الأدوات لقياس مساحة الفجوة (إن وجدت).</li>
	<li>انقر على تحليل، من شريط القوائم، وحدد خيار القياس. هذا وسوف يعرض منطقة الفجوة أو الجرح.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Painless,+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception.">Painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113 (2), 261-273 (2003).</li><li>Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pickpocket+is+a+DEG/ENaC+protein+required+for+mechanical+nociception+in+Drosophila+larvae.">Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae.</a> Current Biology. 20 (5), 429-434 (2010).</li><li>Lopez-Bellido, R., Himmel, N. J., Gutstein, H. B., Cox, D. N., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+for+chemical+nociception+in+Drosophila+larvae.">An assay for chemical nociception in Drosophila larvae.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 374 (1785), 20190282 (2019).</li><li>Lopez-Bellido, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+signaling+regulates+mechanical+nociception+in+flies+and+vertebrates.">Growth factor signaling regulates mechanical nociception in flies and vertebrates.</a> Journal of Neuroscience. 39 (30), 6012-6030 (2019).</li><li>Hu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+integration+and+neuromodulatory+feedback+facilitate+Drosophila+mechanonociceptive+behavior.">Sensory integration and neuromodulatory feedback facilitate Drosophila mechanonociceptive behavior.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1085-1095 (2017).</li><li>Kim, S. E., Coste, B., Chadha, A., Cook, B., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Drosophila+Piezo+in+mechanical+nociception.">The role of Drosophila Piezo in mechanical nociception.</a> Nature. 483 (7388), 209-212 (2012).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Current Biology. 19 (10), 799-806 (2009).</li><li>Babcock, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+regulates+nociceptive+sensitization.">Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization.</a> Current Biology. 21 (18), 1525-1533 (2011).</li><li>Turner, H. N., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury-induced+cold+sensitization+in+Drosophila+larvae+involves+behavioral+shifts+that+require+the+TRP+channel+Brv1.">Injury-induced cold sensitization in Drosophila larvae involves behavioral shifts that require the TRP channel Brv1.</a> PloS One. 13 (12), 0209577 (2018).</li><li>Im, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tachykinin+acts+upstream+of+autocrine+Hedgehog+signaling+during+nociceptive+sensitization+in+Drosophila.">Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila.</a> eLife. 4, 10735 (2015).</li><li>Cervero, F., Merskey, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+noxious+stimulus.">What is a noxious stimulus.</a> Pain Forum. 5 (3), 157-161 (1996).</li><li>Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+global+methods+of+assessing+thermal+nociception+in+Drosophila+larvae.">Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3837 (2012).</li><li>Follansbee, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+nociceptive+sensitization+requires+BMP+signaling+via+the+canonical+SMAD+pathway.">Drosophila nociceptive sensitization requires BMP signaling via the canonical SMAD pathway.</a> Journal of Neuroscience. 37 (35), 8524-8533 (2017).</li><li>Im, S. H., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+insulin+receptor+regulates+the+persistence+of+injury-induced+nociceptive+sensitization.">Drosophila insulin receptor regulates the persistence of injury-induced nociceptive sensitization.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (5), (2018).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+caspase+activity+is+required+independently+of+apoptosis+to+produce+active+TNF/Eiger+during+nociceptive+sensitization.">Drosophila caspase activity is required independently of apoptosis to produce active TNF/Eiger during nociceptive sensitization.</a> Cell Death &amp; Disease. 8 (5), 2786 (2017).</li><li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Current Biology. 17 (24), 2105-2116 (2007).</li><li>Guo, Y., Wang, Y., Wang, Q., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+PPK26+in+Drosophila+larval+mechanical+nociception.">The role of PPK26 in Drosophila larval mechanical nociception.</a> Cell Reports. 9 (4), 1183-1190 (2014).</li><li>Takagi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+connectivity+of+homologous+command-like+neurons+mediates+segment-specific+touch+responses+in+Drosophila.">Divergent connectivity of homologous command-like neurons mediates segment-specific touch responses in Drosophila.</a> Neuron. 96 (6), 1373-1387 (2017).</li></ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

نحن تعديل اختبار الميكانيكية المنشأة1،2،16 باستخدام مسابير ميكانيكية مخصصة ملفقة من خيوط النتينول. تسمح لنا هذه السبائك المعدنية باستخدام خيوط قطر أصغر تتناسب مع حجم يرقات دروسوفيليا. وقد سيطرت على الصيد على أساس خط monofilaments مجال nociception الميكانيكية الطيران حتى الآن2,5,6,16. لدينا خيوط النيتينول الحفاظ على شكلها والضغط المقاس لمدة ~ ~ 3-5 أشهر (في تجربتنا). من خلال تغيير طول وقطر خيوط النتينول ، يمكن للمستخدم توليد مجموعة واسعة من الضغوط التي تمتد من subthreshold إلى استجابة المتداول كاملة تقريبا. على وجه الخصوص، مما يجعل subthreshold تحقيقات أبسط مع خيوط النيتينول قطرها الأصغر. باستخدام هذه التحقيقات، وجدنا أن الضغط، بدلا من القوة، يثير استجابات سلوكية أكثر اتساقا nocifensive4. نبرهن هنا، باستخدام نموذج توعية nociceptive مُنشأ من الأشعة فوق البنفسجية7،10،13، أن هذه الخيوط هي أيضا أداة مفيدة لدراسة فرط الحساسية الميكانيكية - اللودينيا وفرط الاججيزيا.
وقد أدت الدراسات السابقة باستخدام مسابير ميكانيكية ملفقة من خط الصيد إلى بعض التباين في الاستجابة السلوكية2،6،16،17. وقد تكون هناك عدة عوامل تُعدّ في الاعتبار. أولاً، لأن الضغط هو المتغير المهم، فإن تلميع طرف خيوط بحيث يتم تقريبه وليس لديه أي حواف حادة أمر بالغ الأهمية. ثانياً، إن الإبلاغ عن قيم الضغط بدلاً من القوة فقط مهم لقابلية تكرار التجارب، لأن المسابير الميكانيكية المختلفة التي تولد قوى مماثلة يمكن أن تثير ضغوطاً متباينة4. ثالثاً، من المهم تطبيق تحفيز ميكانيكي واحد فقط لكل يرقة باستخدام مسابير ضارة، لأن هذه المسابير تنتج تلفًا يعتمد على الجرعة في الأنسجة التي تعتمد على الجرعة على مستويات الخلايا العصبية الجلديةوالحسية (الشكل 2E). ويمكن للمحفزات الميكانيكية الضارة الثانية أو اللاحقة، بعد أن يتم إحداث تلف الأنسجة، أن تضعف وظيفة الخلايا العصبية الحسية الطرفية المتأثرة وتنتزع استجابة سلوكية معدلة. في دراسة أخرى، اليرقات حفز مرتين مع مسابير ميكانيكية ضارة عرض في الغالب استجابة سلوكية معززة5، مما يشير إلى تطوير الحساسية الميكانيكية الحادة (hyperalgesia)، والتي قد تنتج عن تلف الأنسجة التي أثارها أول حافز ميكانيكي ضارة. على العكس من ذلك، أفاد مؤلفون آخرون6 عن استجابة سلوكية مختلطة (زيادة أو نقصان)، مما يشير إلى أن الاستجابة السلوكية المتغيرة يمكن أن تكون بسبب تلف/خلل في الأنسجة العصبية. تحفيز كل يرقة مرة واحدة فقط يزيل التباين المحتمل في الاستجابات السلوكية الناتجة إما عن التوعية أو تلف الأنسجة. رابعاً، نحن ميكانيكيا حفز الجزء A8، الذي هو أكثر الخلفي من الدراسات السابقة (المناطق المفضلة A3-A4)2،5،16. لم المسابير بين ~ 3900 كيلو باسكال و 5300 كيلو باسكال المطبقة على أي من الجزء A2 أو A8 لم تظهر أي اختلافات سلوكية4. بالإضافة إلى ذلك ، من الأسهل تحفيز A8 ، مقارنة بـ A2 - A4 ، باستخدام المجسات الميكانيكية التي تولد ضغوطًا أقل (<300 كيلو باسكال) لأن اليرقة أرق في هذه المنطقة وبالتالي مضغوطة بسهولة أكبر. وأظهرت دراسات أخرى أن التحفيز الميكانيكي الضار للنهاية الخلفية لليرقة (التي ألقاها دبوس حشرة جامدة ، التي عقدت مع ملقط) أثار في الغالب الحركة إلى الأمام ، بدلا من استجابة 18 aversive أوالمتداول. يمكن أن تكون هذه الاستجابة السلوكية المختلفة بسبب الاختلافات في خصائص المواد المستخدمة (خيوط النيتينول القابلة للانحناء مقابل دبوس الحشرات غير المضغوطة) أو إلى ضغوط مختلفة تم تسليمها إلى اليرقات (لم يتم الإبلاغ عن قيمة ضغط دبوس الحشرة).
وقد مكن تطوير مقايسة nociception الميكانيكية ليرقات الدوزوفيليا الحقل لاكتشاف أن القنوات الأيونية الحسية الميكانيكية المختلفة والدوائر العصبية وساطة nociception الميكانيكية5,6,16,17. ومع ذلك ، فإن دراسة فرط الحساسية الميكانيكية (allodynia وhyperalgesia) قد تخلفت ، مقارنة بالتوعية من طرائق الحسية الأخرى - الحرارة7،8،10،13،14،الباردة9،والكيميائية 3. وقد يرجع هذا التأخر جزئياً إلى عدم وجود مسابير ميكانيكية مناسبة يمكن أن تولد نطاقاً استجابة كاملة تمتد إلى الضغوط فوق الوثارس. ذات أهمية خاصة ، خاصةً لتقييم النياية الميكانيكية ، هي مسابير تحت الهودود لا تثير استجابة متدحرجة من اليرقات غير الموبّعة. أهمية المجس الميكانيكية المحسنة لدينا هي أنها يمكن أن تكون ملفقة لتمتد المحفزات غير ضارة (subthreshold ~ 174 كيلو باسكال -200 كيلو باسكال) أو من المنخفض إلى ارتفاع مجموعة ضارة (suprathreshold ~ 225 كيلو باسكال إلى ~ 5،116 كيلو باسكال). هنا ، نبرهن باستخدام خيوط تشبه nitinol von Frey التي تطور يرقات Drosophila كل من اللودينية الميكانيكية والهايبرجيا الميكانيكية بعد الإشعاع فوق البنفسجي. التوعية الميكانيكية تظهر بعض الاختلافات بالمقارنة مع التوعية الحرارية. كل من بداية وذروة التوعية الميكانيكية في وقت سابق (~ 4 ح) مقارنة بالحساسية الحرارية (الحرارة) (~ 8 ح لhyperalgesia و ~ 24 ساعة للالسودية)7. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الالوينيا الميكانيكية وhyperalgesia يصاحب (على حد سواء الذروة في ~ 4 ساعة). وعلاوة على ذلك، في حين التوعية الحرارة (allodynia وhyalgesia) يحل تماما في وقت لاحق نقاط7، أظهرت فرط الحساسية الميكانيكية ذيل طويل التي ظلت أعلى قليلا من خط الأساس. التوعية الباردة في دروسوفيليا ينطوي على التبديل في السلوكيات الباردة أثار9 وظهور سلوكيات جديدة أثار الباردة - وهي ظاهرة لا يلاحظ مع التحفيز الميكانيكي. هذه الاختلافات في بداية، والمدة، والسلوكيات الملاحظة تشير إلى أن كل طريقة الحسية يمكن التحكم بها من خلال مسارات إشارة مختلفة. الجمع بين الحساسية الموصوفة هنا مع الأدوات الوراثية القوية المتاحة في Drosophila ينبغي أن تسمح تشريح وراثي دقيق للحساسية الميكانيكية (allodynia وhyalgesia) لوحظ.

تظهر يرقات دروسو فيلها سلوك متداول مُميز مميز عند تعرضها لمحفزات ضارة مختلفة:الحرارية 1، الميكانيكية2،والكيميائية 3. هذا السلوك هو واضح يختلف عن الحركة العادية. هنا نحن وصف فحص ميكانيكية محسنة التي يمكن استخدامها لتقييم الحساسية الميكانيكية والحساسية الميكانيكية.
في دراسة حديثة، ونحن ملفقة فون فراي مثل خيوط باستخدام أسلاك نيتينول4. وقد بذلت تحقيقات ممارسة قوى وضغوط مختلفة من خلال تغيير أطوال وأطر الأسلاك نيتينول تشكيل كل مسبار. تم معايرة المسابير الميكانيكية وتم تحويل قيم القوة المقاسة (في الدخنونتون، mN) إلى ضغط (كيلوباسكال، كيلو باسكال)، استنادًا إلى منطقة الطرف لكل مسبار4. تلفيق مخصص من المسبر الميكانيكية يسمح لنا لتوليد subthreshold (≤200 كيلو باسكال) إلى أعلى من هه (225 كيلو باسكال إلى 5318 كيلو باسكال) الضغوط، والتي يمكن، من حيث المبدأ، أن تكون مفيدة لدراسة فرط الحساسية الميكانيكية. باستخدام هذه خيوط فون فراي الميكانيكية المحسنة ، أظهرنا أن الضغط4، على عكس القوة التي تم فحصها سابقًا2،5،6 يرتبط بشكل أكثر اتساقًا بالاستجابة السلوكية الكارهة في يرقات دروسوفيليا. كما ساعد الفحص الميكانيكي المحسن الموصوف هنا على تحديد عامل نمو البطانية الوعائية المحفوظ (VEGF) المرتبط بمستقبلات التيروزين كيناز التي تشير إلى مسار ينظم التنامية الميكانيكية في الذباب والجرذان4.
االعينة الميكانيكية وhyalgesia، وهما طريقتان من فرط الحساسية، هي غير مدروسة نسبيا في يرقات دروسوفيليا، مقارنة مع الحرارية (الحرارة والبرد) والطرائق الكيميائية الحسية3،7،8،9،10. وربما يرجع ذلك إلى عدم وجود تحقيقات ميكانيكية محددة تمتد من المحفزات الضارة إلى النطاق الضار العالي2،5،6. حافز غير ضار عادةً يثير سلوك المتداول المتعرج النموذجي بعد تجربة يرقات دراوسوفيليا تلف الأنسجة3،يشار إلى7 باسم الالوديانيا. ومن المعروف أن استجابة مبالغ فيها المتداول إلى حافز ضارة عادة كما هو مفرط7. يتم تعريف المحفزات الضارة بأنها تلك التي تثير تلف الأنسجة ويمكن تنشيط nociceptors11. المحفزات الضارة تسليمها إلى يرقات Drosophila الضرر إما البشرة الحاجز، والخلايا العصبية الحسية nociceptive الطرفية3،4،7، أو كليهما.
في هذه المقالة، نُوضح كيفية تصنيع ومعايرة المجسّسات الميكانيكية التي تُشبه بـ "فون فري" والمناسبة ليرقات "دروسوفيليا". علاوة على ذلك ، نعرض كيفية استخدام هذه المسابير لمقايسة الاستجابات الناجسية الميكانيكية في يرقات دروسوفيليا. وأخيراً، نبرهن كذلك على فائدة هذه المسابير باستخدامها لإثبات وجود فرط الحساسية الميكانيكية، كلا من الالودينية والهايبرجيا، بعد تلف الأنسجة في يرقات دروسوفيليا (انظر نتائج التمثيل).

<table><tbody><tr><td>Beaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540C</td><td>Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do.</td></tr><tr><td>Black (Arkansas) bench stone</td><td>Dan&amp;rsquo;s Whetstone</td><td>SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C</td><td>Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td>Any equivalent confocal microscope will do</td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-816</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816</td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-500</td><td>For anesthetizing larvae.</td></tr><tr><td>Etherization chamber</td><td></td><td></td><td>This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape.</td></tr><tr><td>Fiber Optic Light Guide</td><td>Schott AG</td><td>A08575</td><td>Schott Dual Gooseneck 23 inch</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tool</td><td>FS-1670</td><td>For transferring larvae</td></tr><tr><td>Glue</td><td>Aleene&#039;s</td><td>N/A</td><td>Aleene&#039;s&amp;reg; Wood Glue, formerly called (Aleene&#039;s All-Purpose Wood Glue)&lt;br/&gt; https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue</td></tr><tr><td>Graspable holder</td><td>Loew Cornell</td><td>N/A</td><td>Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces.</td></tr><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma</td><td>H8898-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic needle 30G 1/2&quot;L</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1471286</td><td>BD Precisionglide&amp;reg; syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires</td></tr><tr><td>Large Petridish</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td>60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish</td></tr><tr><td>Microscope (Zeiss) Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>NT55-605</td><td>Any equivalent microscope will do</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass 22x22</td><td>Fisher</td><td>12-545-B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass 22x40</td><td>Corning</td><td>2980-224</td><td>Tickness 1 1/2</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Globe Scientific Inc.</td><td>1358Y</td><td></td></tr><tr><td>Mini Diagonal Cutter</td><td>Fisher Scientific</td><td>S43981</td><td>For cutting nitinol filaments</td></tr><tr><td>Nitinol filaments, Diameters: 0.004&amp;rdquo;, 0.006&amp;rdquo;, 0.008&amp;rdquo;</td><td>Mailin Co</td><td>N/A</td><td>Fifteen pieces of each diameter of 12&amp;rdquo; length were ordered.&lt;br/&gt; https://malinco.com/</td></tr><tr><td>Piece of black vinyl</td><td>Office Depot</td><td>N/A</td><td>We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva</td></tr><tr><td>Small Petridish</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td>35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td>Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish</td></tr><tr><td>Wipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;W&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3605</td><td>Control strain for behavioral assays</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;ppk-Gal4&gt;UAS-mCD8-GFP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>8749</td><td>Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons</td></tr></tbody></table>

an improved assay and tools for measuring mechanical nociception in drosophila larvae

وقد أدت عمليات الفحص المنشورة للانكارسي في دروسوفيليا إلى تقييمات مختلفة للسلوك. هنا، نحن ملفقة، للاستخدام مع يرقات دروسوفيليا، مخصصة معدنية النيكل والتيتانيوم سبائك (نيتينول) خيوط. هذه المسابير الميكانيكية مماثلة لخيوط فون فراي المستخدمة في الفقاريات لقياس nociception الميكانيكية. هنا، ونحن نبين كيفية جعل ومعايرة هذه المسابير الميكانيكية وكيفية توليد استجابة الجرعة السلوكية الكاملة من subthreshold (غير ضارة أو غير ضارة النطاق) إلى المحفزات فوق الهد (منخفضة إلى عالية الضارة) المحفزات. لإثبات فائدة المسابير ، قمنا بالتحقيق في فرط الحساسية الناجمة عن تلف الأنسجة في يرقات دروسوفيليا. لم يتم بعد تحديد الحساسية الميكانيكية للتحفيز الميكانيكي غير الضار عادةً) وhyalgesia (الاستجابة المبالغ فيها لحافز ميكانيكي ضار) في يرقات دروسوفيليا. باستخدام المسابير الميكانيكية التي عادة ما تكون غير ضارة أو تحقيقات التي تثير عادة سلوكًا غير نشط ، وجدنا أن يرقات Drosophila تطور فرط الحساسية الميكانيكية (كلا من allodynia وhyalgesia) بعد تلف الأنسجة. وبالتالي، فإن المسابير الميكانيكية والمقايسة التي نوضحها هنا من المرجح أن تكون أدوات مهمة لتشريح الآليات الجزيئية/الوراثية الأساسية للحساسية الفائقة الميكانيكية.

قمنا بتطوير مسابير ميكانيكية مخصصة، وذلك باستخدام خيوط النتينول(الشكل 1A,N)،لاستخلاص السلوكيات التي تثيرها ميكانيكيا، وولّد منحنى استجابة الجرعات السلوكية الكاملة باستخدام كل من المسابير الميكانيكية الضارة وغير الضارة ذات الكثافة المختلفة(الشكل 2D)مما يدل على أنه يمكن استخدام هذه المسابير لدراسة خط الأساس (في غياب الإصابة) nociception الميكانيكية.
نتائجنا اختبار السلوكي تحديد أن تحقيقات ممارسة الضغوط أقل من 200 كيلو باسكال (~ 1.57 م)(الشكل 1M)،عند تطبيقها على يرقات دروسوفيليا، لا تثير استجابة المتداول aversive(الشكل 2D والفيديو 3). وكما هو متوقع، فإن هذه المسابير الميكانيكية غير الضارة أو غير الضارة (175 كيلو باسكال أو 200 كيلو باسكال) لم تثر تلف الأنسجة العصبية المرئية(الشكل 2E). لأنها لا تسبب الضرر، مثل هذه المسابير يمكن أن تكون مفيدة لتقييم الوهودينيا الميكانيكية (فرط الحساسية إلى المحفزات الميكانيكية غير ضارة عادة). وعلى العكس من ذلك، فإن المسابير فوق الهد أو الضارة (من 462 كيلو باسكال إلى 5116 كيلو باسكال) أثارت استجابة سلوكية معززة(الشكل 2D)بطريقة تعتمد على الجرعة - مع الضغوط الأعلى التي تثير استجابات سلوكية أقوى. كما هو متوقع، الضغط الميكانيكي فوق الرثهولد أيضا تسبب الضرر الأنسجة تعتمد على الجرعة إلى الخلايا العصبية الحسية المحيطية نفسها(الشكل 2E). وكانت المساحة المقاسة لتلف الأنسجة (في ميكرومتر2 ± الانحراف المعياري) المأخوذة من أربع يرقات لكل مجموعة: 2,051.03 ± 703.81 (462 كيلو باسكال), 5,102. 29 ± 1,004.67 (2,283 كيلو باسكال)، و12,238.83 ± 3,724.11 (5,116 كيلو باسكال). وهكذا، فإن الضغوط أكبر من أو تساوي 462 كيلو باسكال (~63 م.ن)، والتي تثير استجابة متدحرجة (في 25٪ أو أكثر من اليرقات) وتسبب تلف الأنسجة العصبية المرئية(الشكل 2E)، يمكن أن تكون مناسبة لدراسة فرط الحساسية الميكانيكية (فرط الحساسية للمحفزات الميكانيكية الضارة عادة). تحقيقات الميكانيكية Nociceptive (≥462 كيلو باسكال) دائماً الحث على تلف الأنسجة (ن = 10، تقييم نوعي) ولكن لا تثير دائما استجابة المتداولة aversive.
لتقييم فرط الحساسية الميكانيكية (allodynia وhyalgesia)، استخدمنا نموذج يرقات Drosophila راسخة من الحساسية nociceptive التي تستخدم الأشعة فوق البنفسجية (UV) الإشعاع للحث على تلف الأنسجة7،12. وقد ساعد هذا الفحص على تشريح الآليات الوراثية والخلوية للحساسية الحرارية النابيةالمفرطة 8،9،10،13،14،15. لتحديد ما إذا كان العلاج بالأشعة فوق البنفسجية يسبب الحساسية الميكانيكية، منتصف التحكم في النجوم الثالثة(ث1118)كانت اليرقات وهمية المشععة أو الأشعة فوق البنفسجية المشعة (15-20 mJ/cm2) (الشكل 3A). ثم تم اختبار اليرقات سلوكياً عند 2 ساعة و4 ساعات و8 ساعات و16 ساعة و24 ساعة بعد المعالجة بمسبار ميكانيكي تحت الهد (200 كيلو باسكال ، 1.57 م.ين). وقد استجاب ما يقرب من 20٪ من اليرقات في وقت مبكر من 2 ساعة بعد العلاج بالأشعة فوق البنفسجية في حين أن 50٪ استجابت في 4 ساعات ، مقارنة مع 6.6 ٪ و 8.3 ٪ وهمية الحيوانات الأشعة فوق البنفسجية المشعة ، على التوالي(الشكل 3B). وهذا يشير إلى أن تلف الأنسجة الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية يسبب الالودينيا الميكانيكية في 4 ح بعد التشعيع. في وقت لاحق من النقاط (8 ساعات، 16 ساعة، و 24 ساعة) كانت الاستجابة السلوكية لليرقات المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية في حدود 16٪ -20٪ مستجيبة (متوسط متوسط n = 3-6 مجموعات من 10 يرقات لكل من) ، زيادة طفيفة (ولكن ليس ذات دلالة إحصائية) مقارنة بمجموعة التحكم المشععة الوهمية (في حدود 3٪ -6٪ من المستجيبين، متوسط متوسط ن = 3-6 مجموعات من 10 يرقات لكل من ) (الشكل 3B).
للتحقيق في فرط الحساسية الميكانيكية ، وهو ضغط فوق الحساسية (462 كيلو باسكال ، 3.63 م ن) ، الذي يؤدي عادة إلى استجابة متدحرجة في ~ 20 ٪ من اليرقات (الشكل 2D)ويسبب تلف الأنسجة العصبية(الشكل 2E)، تم استخدامه. طبقنا مسبار 462 كيلو باسكال على الجانب الظهري من اليرقات مع أو بدون تلف الأنسجة الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية(الشكل 3A). وجدنا أن اليرقات مسبر في 4 ح، 8 ح، و 16 ح بعد العلاج بالأشعة فوق البنفسجية أظهرت زيادة كبيرة في استجابة المتداول aversive، مع 4 ح كونها ذروة فرط الحساسية السلوكية (~ 60٪ استجابة)؛ أظهرت الحيوانات الأشعة فوق البنفسجية المشعة وهمية ~ 27٪ من استجابة aversive(الشكل 3C). على غرار الالعيار الميكانيكي، الاستجابة السلوكية في 8 ساعات، 16 ح، و 24 ساعة من الحيوانات المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية (في حدود 36٪ -42٪) لا يمكن أن يتم تحديدها إحصائياً عن اليرقات غير المعالجة (في حدود 20٪ –26٪). اليرقات في مرحلة أواخر الثالث فيستار لم تظهر انخفاضا طفيفا من الاستجابة السلوكية الأساسية بالمقارنة مع المرحلة الثالثة الوسطى. نحن افترض أن هذا يمكن أن يكون إما بزيادة حجم اليرقات (الشكل 2A) أو زيادة سمك بشرة تغطي الجسم. يمكن أن تفسر هذه الحقيقة لماذا في مرحلة لاحقة من التنمية العلاج الأشعة فوق البنفسجية لا تحفز على زيادة التوعية الميكانيكية، كما لوحظ 4 ح العلاج بالأشعة فوق البنفسجية.
معا، تشير نتائجنا إلى أن يرقات دروسوفيليا تطوير كل من الالودينية الميكانيكية والهايبرجيا الميكانيكية بعد تلف الأنسجة الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية. وقت الذروة من الالودينيا الميكانيكية وhyperalgesia هو نفسه، 4 ح بعد العلاج بالأشعة فوق البنفسجية. ومع ذلك، هوبرالجيسيا الميكانيكية لديها ذيل الصدغي أكثر وضوحا كما أنه يعود إلى خط الأساس أكثر ببطء مقارنة مع الالوينيا الميكانيكية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig01.jpg"> الشكل 1: تطوير أداة تشبه فون فراي لتقييم النوستيسيون الميكانيكي في يرقات دروسوفيليا. (أ) صورة مسبار ميكانيكي يستخدم لدراسة النوستيسيون الميكانيكي في يرقات دروسوفيليا. (ب)تظهر خيوط النيتينول وأقطارها النسبية بمقياس نسبي. (C) صورة قاطع الأسلاك القطري المستخدم لقطع خيوط النتينول. (D) تجانس الحواف الحادة لخيوط النيتينول المقطوعة مع حجر شحذ. (E) إبرة تحت الجلد تستخدم لجعل حفرة في مقبض عصا الملوثات الخشبية الخشبية للمسبار. يجب أن يصل طرف الإبرة إلى نصف ارتفاع مقبض عصا على الأقل من أجل إدخال خيوط آمنة. (F-G) مرفق خيوط النيتينول عن طريق الإلتصاق في مقبض عصا الملوثات الخشبية الخشبية مع ثقب الإدراج. (H-L) معايرة المسابير الميكانيكية عن طريق الضغط عليها ضد مقياس. (M)قيم القوة (في mN) والضغط (في كيلو باسكال) التي تم إنشاؤها بواسطة تحقيقات ميكانيكية مختلفة. طول كل خيوط النتينول المستخدمة لبناء المسابير (P1-P10؛ P: مسبار) مفصلة في السنتيمتر (سم). (N) صورة لمجموعة كاملة من المسابير الميكانيكية، تتراوح بين 174 كيلو باسكال إلى 5،116 كيلو باسكال. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61911/61911fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig02v2.jpg"> الشكل 2: مقايسة nociception الميكانيكية: فون فراي مثل خيوط توليد منحنى الجرعة استجابة للسلوك المتداول aversive وتسبب تلف الأنسجة إلى الخلايا العصبية الحسية. (أ) صور للمراحل المختلفة (الثانية والثالثة من اليرقات الدوزوفيلية. شريط مقياس: 2 مم.(ب)الكرتون من وجهة نظر الظهر من يرقات الدروسوفيا الثالث. تشير النقطة الحمراء إلى الجزء البطني الذي يتم فيه تطبيق المسبار الميكانيكي. T: الجزء الصدري; A: الجزء البطني. وتوجد علامات أخرى على معالم تشريحية. (C) رسوم متحركة من المقايسة: يتم تطبيق مسبار ميكانيكي على الجانب الظهري من اليرقة حتى تنحني على السطح أدناه ثم يتم عقد لمدة 2 s. إذا كان الضغط مرتفعًا بما فيه الكفاية ، فإن هذا يثير استجابة متدحرجة عند الإصدار. (د) استجابة الجرعة السلوكية؛ كل نقطة زرقاء تمثل نسبة اليرقات التي استجابت ، مع المتداول المُلَكِف ، إلى التحفيز الميكانيكي ضمن مجموعة من 10. كمان مؤامرة من نسبة من السلوك المتداول aversive الناجمة عن تحقيقات ميكانيكية مختلفة. كيلو باسكال: كيلوباسكال. تمثل قطع الأراضي المربعة الوسيط (الأخضر)، والشعيرات (الحمراء) تمثل المئينين 10 و90. (E)تلف الأنسجة: تم فحص يرقات النجوم الثالثة (من النمط الجيني ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP لتسمية الخلايا العصبية الحسية النوفية) في الجزء الظهري A8 مع الضغوط المشار إليها. ثم تم فحص الخلايا العصبية الحسية ذات الفئة الرابعة من فئة ddaC (عبر خط الوسط الظهري) (انظر القسمين 4 و5). المناطق البيضاء (العلامات النجمية الحمراء) تمثل الثغرات أو تلف الأنسجة. شريط مقياس: 100 μm. في اللوحة B ، تظهر اليرقة في المنظر الظهري ، بينما في C هو المنظر الجانبي. تحقيقات ميكانيكية الضغط ضد الجانب البشرة البشرة الظهرية من اليرقة تنتج الاكتئاب مثل جيب عند نقطة التماس من غيض من التحقيق والمناطق المحيطة بها. الخط الأسود الصلب المنحني نحو الجانب البطني هو الجزء العلوي من الجيب، بينما يمثل الخط الجانبي الرمادي المتقطع الجانب الجانبي وأسفل الجيب. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61911/61911fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig03v2.jpg"> الشكل 3: فرط الحساسية الميكانيكية بعد تلف الأشعة فوق البنفسجية. (أ) التخطيطي للتصميم التجريبي لاختبار التوعية. منتصف الثالث instar كانت تعامل وهمية (غير الأشعة فوق البنفسجية) أو الأشعة فوق البنفسجية المشعة. ثم تم إجراء فحص الحساسية الميكانيكية في وقت مختلف (2 ساعة ، 4 ح ، 8 ح ، 16 ساعة ، و 24 ساعة) بعد العلاج الوهمي أو التشعيع. (ب) الالاثل النية الميكانيكية: النسبة المئوية لليرقات التي تظهر تدحرجاً مفتاراً بعد التحقيق مع حافز ميكانيكي عادة تحت الانبعاثات أو غير ضارة (200 كيلو باسكال، 1.57 م.ن) عند النقاط الزمنية المشار إليها بعد المعالجة الوهمية أو الإشعاع فوق البنفسجي. (C)فرط الحساسية الميكانيكية: النسبة المئوية لليرقات التي تظهر تدحرجاً مُنفَذاً بعد الادّح مع حافز ميكانيكي فوق الكبري أو ضار عادة (462 كيلو باسكال، 3.63 م.ن) عند نقاط الوقت المشار إليها بعد المعالجة الوهمية أو التشعيع فوق البنفسجي. وتشير شرائط الخطأ إلى متوسط +/- SEM. تم استخدام اختبار t-غيرمُبَدّد ذو ذيلين للتحليل الإحصائي: * p < 0.05، **p < 0.01؛ *p 0.05، **p < 0.01؛ *p 0.05، **p < 0.01؛ p 0.05، **p 0.01؛ ns: ليست كبيرة. كل نقطة حمراء، في اللوحات B و C، تمثل النسبة الوسطية لـ 10 يرقات، n = 3-6 مجموعات لكل نقطة زمنية/حالة. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61911/61911fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
فيديو 1: الحركة العادية ليرقات دروسوفيليا. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61911/Video_1_regresolu.mp4" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>
فيديو 2: التحفيز الميكانيكي الضار ليرقات دروسوفيليا. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61911/Video_2_regresol.mp4" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>
فيديو 3: التحفيز الميكانيكي دون الكبر هو من يرقات دروسوفيليا. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61911/Video_3_Subthreshold_short.mp4" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae at JoVE.com

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار كيفية إجراء فحص محسن للانكارية الميكانيكية في يرقات دروسوفيليا. نستخدم الفحص هنا لإثبات أن فرط الحساسية الميكانيكية (الوسوفيا وhyperalgesia) موجود في يرقات دروسوفيليا.

فحص محسن وأدوات لقياس النوسسيبل الميكانيكي في يرقات دروسوفيليا

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

an-improved-assay-tools-for-measuring-mechanical-nociception

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Behavior

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

4.7K Views.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center. الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار كيفية إجراء فحص محسن للانكارية الميكانيكية في يرقات دروسوفيليا. نستخدم الفحص هنا لإثبات أن فرط الحساسية الميكانيكية (الوسوفيا وhyperalgesia) موجود في يرقات دروسوفيليا.

Video: An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

عالية الدقة قياس سلوك رائحة يحركها يرقات ذبابة الفاكهة في

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Biology

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

باستخدام رقائق الموائع الدقيقة للتصوير لايف ودراسة الردود الإصابات في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Bioengineering

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

المحلية والعالمية طرق تقييم Nociception الحرارية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Neuroscience

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Immunology and Infection

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain perception in rodents. Withdrawal thresholds can be measured first at baseline and then following drug, venom, injury, allergen,&#160;or otherwise evoked inflammation by applying an accurate force on very specific areas of the skin. An electronic von Frey apparatus allows precise assessment of mouse hind paw withdrawal thresholds that are not limited by the available filament sizes in contrast to classical von Frey measurements. The ease and rapidity of measurements allow for incorporation of assessment of tactile sensitivity outcomes in diverse models of rapid-onset inflammatory and neuropathic pain as multiple measurements can be taken within a short time period. Experimental measurements for individual rodent subjects can be internally controlled against individual baseline responses and exclusion criteria easily established to standardize baseline responses within and across experimental groups. Thus, measurements using an electronic von Frey apparatus represent a useful modification of the well-established classical von Frey filament-based assays for rodent mechanical allodynia that may also be applied to other nonhuman mammalian models.

Electronic von Frey measurements are an effective and improved alternative to classical von Frey filaments, as they allow rapid and precise measurement of changes in rodent mechanical withdrawal thresholds to continuously applied pressure stimuli before and after an inflammatory event.

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

النسخ في والسلوكية الفحص لMechanosensation من MARCM المستندة<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

إزالة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة العضلية من اليرقات شرائح التحليل المناعي من العصبونات الحسية وخلايا البشرة

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

رواية الفحص لالباردة حس الألم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

A بسيطة العصبية الميكانيكية إصابة منهجية للدراسة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; موتور العصبون التنكس

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Local Heat Probe Assay: A Method to Assess Nociception of High Temperatures in Drosophila Larvae

Source: Chattopadhyay, A., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/3837/" target="_blank">Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2012).
Drosophila larvae have dedicated sensory neurons&#8211;nociceptors&#8211;whose response to potentially harmful thermal stimuli triggers aversive&#8211;or so-called &#34;nocifensive&#34;&#8211;behaviors in the animal. This video describes a method to assess thermal nociception by recording larval behavior in response to local application of a heat probe onto the cuticle. This method is, therefore, called the local heat probe assay.

فحص المسبار الحراري المحلي: طريقة لتقييم الشعور بالألم في درجات الحرارة المرتفعة في ذبابة الفاكهة

Source: Chattopadhyay, A., et al. Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2012).
Drosophila larvae ...

فحص محسن وأدوات لقياس النوسسيبل الميكانيكي في يرقات دروسوفيليا

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

عالية الدقة قياس سلوك رائحة يحركها يرقات ذبابة الفاكهة في

باستخدام رقائق الموائع الدقيقة للتصوير لايف ودراسة الردود الإصابات في

المحلية والعالمية طرق تقييم Nociception الحرارية في

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

النسخ في والسلوكية الفحص لMechanosensation من MARCM المستندة

إزالة

رواية الفحص لالباردة حس الألم في

A بسيطة العصبية الميكانيكية إصابة منهجية للدراسة

فحص المسبار الحراري المحلي: طريقة لتقييم الشعور بالألم في درجات الحرارة المرتفعة في ذبابة الفاكهة