הפרוטוקול שלנו מספק גישה מעשית שבאמצעותה טחול עכבר ובלוטות לימפה ניתן להשתמש כדי לשקף את הדינמיקה של תגובת תא T גדול יותר מאשר מתן תמונה פנוטיפית במצב יציב. הטכניקה שלנו מזהה ברגישות תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן העוסקים בתגובה מתמשכת. תאי CD8 T מתרבים נמדדים ללא ההשפעות המבלבלות של טיפול תרופתי ב- vivo או העברת תאים.
הטכניקה שלנו יכולה לספק חלון בדינמיקה החיסונית במספר הגדרות. לדוגמה, ביחס לתגובה לחיסון וזיהומים, מחלות אוטואימוניות ואימונותרפיה לסרטן. הכן מאגר שטיפה טרי של 1x permeabilization על ידי דילול מאגר פרמזיזציה של פי 10 עם מים מזוקקים וסינן אותו דרך מסנן 0.45 מיקרומטר כדי למנוע אגרגטים.
לדלל נוגדן חד שבטי Ki67 FITC ב 1x permeabilization לשטוף חוצץ כפי שנקבע עם ניסוי titration עבור נפח סופי של 100 microliters לכל מדגם. הוסף 3 מיליליטר של 1x permeabilization לשטוף חוצץ לכל צינור עם תאים צנטריפוגה ב 400 G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. זרוק את סופר-טבעי.
שוב, מוסיפים את 1x permeabilization לשטוף חוצץ צנטריפוגה כדי גלולה את התאים. לאחר מכן, זרוק את סופרנטנט. הוסף 100 מיקרוליטרים של נוגדן חד שבטי מדולל Ki67 FITC לכדור, ואז מערבולת ודגרה במשך 30 דקות בחושך.
לאחר הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 4 מיליליטר של 1x permeabilization חוצץ, centrifuging לאחר כל לשטוף, ולהשליך את supernatant. הוסף 350 מיקרוליטרים של PBS לכדור התא כדי שדגימות יירכשו ישירות בציטומטר הזרימה ו -250 מיקרוליטרים של PBS לכדור התא כדי שדגימות יתדגרו עם Hoechst להכתמת DNA. הכן את תמיסת Hoechst ו- PBS והוסף אותו לכל דגימה כך שהריכוז הסופי הוא שני מיקרוגרם למיליליטר.
מערבולת ודגרה הדגימות במשך 15 דקות בחושך. לאחר מכן, צנטריפוגות הדגימות במשך חמש דקות ולהוסיף 350 microliters של PBS לכדור התא. פתח את התוכנה וצור קבוצות שונות המתאימות לאיברים השונים שיש לנתח על-ידי לחיצה על צור קבוצה"במקטע רצועת הכלים של סביבת העבודה.
פתח את חלון הקבוצה שהשתנה על-ידי לחיצה כפולה על שם הקבוצה וסנכרן את הקבוצות החדשות שנוצרו על-ידי הוספת סימן ביקורת על הפונקציה המסונכרנת. גרור כל קובץ FCS לקבוצה המתאימה לו ולאחר מכן צור אסטרטגיית gating החל מקבוצת a-LN. פתח את חלון הגרף על-ידי לחיצה כפולה על המדגם המוכתם במלואו כדי להציג את האירועים המנוכרים שנרכשו עבור המדגם בפתיחת נקודה.
שים לב שציר ה- x ו- y מסומנים כמו בקבצי FCS, כפי שצוין בטבלה שתיים של קובץ הגדרות ציטומטר הזרימה של כתב יד זה. ודא כי מוצג מספר מספיק של אירועים עבור פריט חזותי מתאים. במידת הצורך, פתח העדפות על-ידי לחיצה על סמל הלב ברצועת הכלים של סביבת העבודה, בחר תרשימים ולאחר מכן נקודה התוויית "כסוג גרף, ובדוק שמספר הנקודות שצוירו בתיבה המתאימה הוא נכון או לשנות אותו.
הצג את האירועים המנוכרים בחלון הגרף בפתילת נקודות עם DNA-A על ציר ה- x ו- DNA-W בציר ה- y. השתמש בקנה מידה ליניארי עבור שני הצירים. במידת הצורך שנה קנה מידה לוגריתמי ליניארי על-ידי לחיצה על התיבה המצוינת עם T קרוב לכל ציר בחלון התרשים.
בחר אוכלוסיית תא בודד על-ידי לחיצה על מלבן במקטע כלי הגינג ולאחר מכן לחץ פעמיים במרכז השער המלבני כדי להציג תאים בודדים בפתילת נקודה עם פרמטר FSC-A בציר x ותא מת מת על ציר ה- y. לחץ על המצולע כדי לבחור את אוכלוסיית התאים החיים, אשר שליליים למות תאים מתים. לחץ פעמיים במרכז שער המצולע כדי להציג את התאים בפתילציית נקודה עם הפרמטר FSC-A בציר x והפרמטר SSC-A בציר ה- y.
לחץ על מלבן וליצור שער רגוע לכלול את כל התאים החיים יחיד בגרף זה. לחץ פעמיים במרכז השער הרגוע כדי להציג את התאים בחלקת נקודות עם CD3 בציר ה- x ו- CD8 בציר ה- y. השתמש בסולם הגישה המתאים לפריט חזותי בחלון התרשים.
במידת הצורך, שנה את סולם x ו- y על-ידי לחיצה על התיבה, המצוינת עם T קרוב לכל ציר, בחר התאמה אישית של פונקציית Access ושנה עשורים נוספים של שלילה עם בסיסים ועשורים חיוביים לפי הצורך. בחר את התקליטורים +CD8+על-ידי לחיצה על מצולע. לחץ פעמיים במרכז שער CD3+CD8+כדי להציג את התאים בחלקת נקודות עם Tetr-gag על ציר ה- x ו- Pent-gag על ציר ה- y.
בחר את תאי ה- CD8 T הספציפיים לאנטיגן על-ידי לחיצה על מצולע. לחץ פעמיים במרכז השער הספציפי למחסום כדי להציג את התאים בחלקת נקודות עם DNA-A על ציר ה- x ו- Ki67 על ציר ה- y. בחר את התאים בשלבי מחזור התא השונים על ידי לחיצה על Quad"במקטע כלי הגינג של חלון התרשים.
העתק את אסטרטגיית הגטינג שנוצרה במדגם אחד לקבוצה המתאימה כדי להחיל את השערים על כל הדגימות של הקבוצה. לאחר מכן העתק אסטרטגיות גטינג עבור קבוצות הטחול b ו- CBM, כמתואר בכתב היד של הטקסט. ודא שכל השערים מתאימים לכל מדגם של שלוש הקבוצות.
במידת הצורך, בטלו את סנכרון הקבוצה ושנו שערים כמתואר בכתב היד. הצג את תאי ה- BM של השער הרגוע בחלקת נקודות עם DNA-A על ציר ה- x ו- Ki67 על ציר ה- y. הצג את התוצאות באופן חזותי על-ידי לחיצה על עורך הפריסה", במקטע רצועת הכלים של סביבת העבודה.
גרור כל שער של אסטרטגיית הג'יטינג בחלונית לדוגמה לעורך הפריסה והצב את התוויות בהתאם לרצף הג'יטינג. במידת הצורך, שנה את סוג התרשים על-ידי לחיצה כפולה על התוויית התוויה המתאימה בפריסה ובחירת הסוג המתאים בחלון הגדרת התרשים. לחץ על הקבוצה וחזר על ידי פונקציות ברצועת הכלים לפריסה כדי לדמיין את התוצאות שהושגו בתאי CD8 T ספציפיים אנטיגן מכל איבר ולהשוות דגימות שונות.
דמיינו תוצאות של תאי מח עצם המייצגים שליטה חיובית. דוגמה אופיינית לניתוח מחזור התא של תאי מח העצם מוצגת כאן. הפרוטוקול הניב מקדם נמוך של וריאציה של G0 ל- G1 ו- G2 לפסגות DNA M, המציין איכות מעולה של כתמי ה- DNA.
אסטרטגיית גטינג בת חמישה שלבים הופעלה כדי לזהות תאי CD8 ספציפיים לאנטיגן. שני multimers שימשו כדי לשפר את הרגישות של זיהוי תאי CD8 T ספציפיים למחסום בעכברים מחוסנים מבלי להגדיל את הרקע הכתים בעכברים לא מטופלים. תאי CD8 T ספציפיים למחסום הניקוז ובטחול מכילים שיעור גבוה של תאים בשלבי S-G2/M ביום השלישי לאחר הדחיפה.
יתר על כן, תאי CD8 T ספציפיים למחסום בשלבי S-G2/M היו בעלי FSC-A ו- SSC-A גבוהים כאשר הם היו על גבי תאי ה- CD8 T הכוללים מאותו איבר. היסטוגרמות היסטות הראו כי ביטוי CD62L על ידי תאי CD8 T ספציפיים למחסום היה נמוך, כצפוי עבור תאי T מופעלים, למעט כמה תאים ב- G0 בבלוטות הלימפה. שיטה זו מיועדת לתאי T כדי להשיג איכות מצוינת של כתמי DNA יחד עם הממברנה והכתמת Ki67.
ניתוח נתוני ציטומטריית זרימה הוא נקודת מפתח. הקפד להשתמש בבקרה מתאימה למיקום השער. בשיטה זו גילינו תאי T בשלבי S-G2/M של מחזור התאים בעכבר ובדם ההיקפי האנושי.
טכניקה זו הייתה שימושית במחקרים ניטור אימונו בסוכרת מסוג 1, מונונוקלאוזיס זיהומיות, ו- COVID-19.
