Name: a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue
Uploaded: 2020-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי מענקי NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 &32 הכשרה גרנט 5T32GM081740

כל הפרוטוקולים של בעלי החיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת דרום קרוליינה.
1. הכנת פתרון מלאי
<ol><li>פתרון 1 (1 ליטר): ל 900 מ"ל של H2O deionized להוסיף 100 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט 10x (PBS) ו 2 מ"ל של טריטון X-100.</li>
	<li>פתרון 2 (1 ליטר): ל 900 מ"ל של H2O deionized, להוסיף 100 מ"ל של 10x PBS, 2mL של Tween-20 ו 1 מ"ל של 10 מ"ג / מ"ל פתרון מלאי הפרין.</li>
	<li>פתרון 3 (500 מ"ל): ל-400 מ"ל של פתרון 1, הוסף 11.5 גרם של גליצין ו-100 מ"ל של דימתילסולפוקס (DMSO).</li>
	<li>פתרון 4 (50 מ"ל): ל 42 מ"ל של פתרון 1, להוסיף 3 מ"ל של סרום מתאים ו 5 מ"ל של DMSO.</li>
	<li>פתרון נוגדנים ראשי (50 מ"ל): ל 46 מ"ל של פתרון 2, להוסיף 2.5 מ"ל של DMSO ו 1.5 מ"ל של סרום מתאים.</li>
	<li>פתרון נוגדנים משני (50 מ"ל): ל 48.5 מ"ל של פתרון 2, להוסיף 1.5 מ"ל של סרום מתאים. הערה: עבור פתרון 4, פתרון ראשוני, פתרון משני, להשתמש בסרום המתאים עם הנוגדן המשני (למשל, עז, סוס, שור).</li>
</ol>2. הכנת מדגם
הערה: בצע שלבים 2.1 עד 2.7 במכסה המנוע של אדים עקב הגבלת החשיפה ל- PFA.
<ol><li>עכברוש צעיר מאוד (3-6 שבועות) באמצעות סבופלורן; המשך ל 2.2 כאשר חולדה אינה מגיבה ואינה מגיבה לצביטת בוהן וזנב.</li>
	<li>מניחים את החולדה בתנוחה על-חניכית וגורמים חתכים דרך דופן הבטן באמצעות זוג מספריים של איריס.</li>
	<li>חותכים דרך החלק התחתון של כלוב הצלעות לעצם הבריח משני צידי כלוב הצלעות באמצעות מספריים מאיו.</li>
	<li>מדביק את החזה והצלעות הרחק מהלב והריאות עם hemostat.</li>
	<li>לנקב את החדר השמאלי עם מחט 23 G מחובר משאבת זלוף לחתוך את האטריום הימני עם מספריים איריס.</li>
	<li>בצע זלוף עירוי עם כ 75 מ"ל של 100 mM (1x) PBS.</li>
	<li>המשך זלוף עירוי קרדית עם כ 100 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) חוצץ ב 1x PBS.</li>
	<li>הסר את המוח מהגולגולת באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>מניחים את המוח במצב קשת ופורסים ל-4 חלקים שווים (ברוחב של כ-3 מ"מ) באמצעות סכין גילוח ומטריצת מוח חולדה.</li>
	<li>תקן כל סעיף ב- 4% PFA ב- 1x PBS בצינור פלסטיק אטום, 5 מ"ל למשך הלילה ב 4 °C (70 °F) על שייקר.</li>
	<li>המשך לתקן ב 4% PFA ב 1x PBS בטמפרטורת החדר (RT) על שייקר עבור 1 שעה.</li>
	<li>לשטוף כל סעיף עם 1x PBS ב RT במשך 30 דקות, 3 פעמים.</li>
</ol>3. התייבשות ודפיגמנטציה
<ol><li>לדגור על המדגם בתמיסת מים דו-שנתית של 20% מתנול/80% למשך שעה אחת ב-RT.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 40% מתנול / 60% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 60% מתנול / 40% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 80% מתנול / 20% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור על המדגם ב 100% מתנול במשך 1 שעה ב RT. חזור עם יותר 100% מתנול, דגירה במשך 1 שעה ב RT.</li>
	<li>מצננים את המדגם ב 100% מתנול ב 4° C במשך כ 10 דקות.</li>
	<li>הכן פתרון מתנול 66%./33%.</li>
	<li>לדגור את המדגם לילה בתמיסת DCM / מתנול ב RT, עם רועד.</li>
	<li>לשטוף עם מתנול ב RT במשך 30 דקות, 2 פעמים.</li>
	<li>מצננים את המדגם ב 100% מתנול ב 4° C במשך כ 10 דקות.</li>
	<li>אקונומיקה במצנן, מוכן טרי 5% מי חמצן במתנול לילה ב 4° C.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 80% מתנול / 20% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 60% מתנול / 40% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 40% מתנול / 60% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור על המדגם בתמיסת מים דו-שנתית של 20% מתנול/80% למשך שעה אחת ב-RT.</li>
	<li>לדגור על המדגם ב 1x PBS עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>יש לשטוף בפתרון 1 למשך שעה אחת ב-RT, פעמיים.</li>
</ol>4. כולרה רעלן Subunit B תיוג
<ol><li>הכנס קצה מחט של מזרק 1 מ"ל לתוך אתר גרעין accumbens.</li>
	<li>להזריק לאט 2.5 μL של 1% ביוטין-CTB מעל 20 s.</li>
	<li>השאירו את קצה המחט במקום במשך 1 דקות ולהסיר לאט מעל 10 s כדי למנוע דליפה.</li>
</ol>5. יישום נוגדנים
<ol><li>לדגור על המדגם בפתרון 3 במשך יומיים ב 37 °C (50 °F) באמבט מים.</li>
	<li>לדגור על המדגם בפתרון 4 במשך יומיים ב 37 °C (50 °F) באמבט מים.</li>
	<li>דגירה עם נוגדן ראשוני במשך 7 ימים ב 37 °C (50 °F) באמבט מים.</li>
	<li>יש לשטוף בתמיסה 2 למשך 5 פעמים, תוך כדי הדגירה של שעה אחת לכביסה. יש לאחסן בפתרון 2 ב-RT למשך הלילה.</li>
	<li>דגירה עם נוגדן משני במשך 7 ימים ב 37 °C (50 °F) באמבט מים.</li>
	<li>לשטוף בתמיסה 2 במשך 5 פעמים, דגירה 1 שעה לכל לשטוף; יש לאחסן בפתרון 2 ב-RT למשך הלילה. הערה: כל השלבים מ- 5.6 ואילך, כולל אחסון סופי, צריכים להתרחש באור נמוך. צינורות מדגם ניתן להגן עם רדיד אלומיניום. הריכוזים המשמשים לנוגדנים בפרוטוקול זה היו: TH בשעה 1: 100, איבה1 בשעה 1: 200, ואת הנוגדן המשני בשעה 1: 100. הוסף פתרון נוסף 2 לשלבים 5.1-5.6 כדי להבטיח שצינורות מלאים לחלוטין.</li>
</ol>6. ניקוי רקמות
<ol><li>לדגור על המדגם בתמיסת מים דו-שנתית של 20% מתנול/80% למשך שעה אחת ב-RT.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 40% מתנול / 60% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 60% מתנול / 40% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 80% מתנול / 20% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור על המדגם ב 100% מתנול עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>דגירה טרי 100% מתנול לילה ב RT.</li>
	<li>דגירה ב 66% DCM / 33% מתנול במשך 3 שעות, עם רועד, בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה באתר דיבנזיל (DBE) מבלי לרעוד. השאר את המדגם ב- DBE עד ניקוי ולאחסן ב- DBE עד הדמיה.</li>
</ol>7. הרכבה
<ol><li>קבל תא מודפס בתלת-ממד העשוי משרף קריסטל Visijet M3 (תבניות הזמינות באתר האינטרנט idisco.info).</li>
	<li>אבטחו את התא לשקופית מיקרוסקופ באמצעות אפוקסי.</li>
	<li>מניחים את הדגימה בחלל המרובע באמצע התא.</li>
	<li>מלא את התא לחלוטין עם DBE.</li>
	<li>מניחים כיסוי בעובי 0.17 מ"מ מעל התא ומפעילים לחץ עד שלכיסוי יש מגע מלא עם קירות התא.</li>
	<li>אוטמים את קצות כיסויי הכיסוי לתא באמצעות האפוקסי.</li>
	<li>סובבו את התא כדי לאפשר לבועות אוויר לברוח ממפרצון המילוי.</li>
	<li>מלא את התא ב- DBE נוסף.</li>
	<li>לאטום את מפרצון המילוי עם אפוקסי ולאפשר לרפא. הערה: עודף DBE יישפך במהלך הרכבה.</li>
</ol>8. הדמיה
<ol><li>השתמש במערכת מיקרוסקופ קונפוקלית כדי לבצע סריקת z בהגדלה פי 4 (ראה וידאו תלת-ממדיהמצורף ).</li>
	<li>להשיג עירור פלואורסצנטי של המדגם באמצעות ערכת לייזר לפלוט אורך גל דומה לאורך הגל שצוין על ידי הנוגדן המשני. עירור TH הושג תוך שימוש בערכת לייזר HeNe לפלוט ב 632 ננומטר.</li>
	<li>הגדר את הגלאי אורך גל קרוב לפליטת הלייזר. עבור הפרוטוקול הנוכחי, הגלאי עבור TH הוגדר 650 ננומטר.</li>
	<li>להעלות את הרווח של הגלאי עד שיש אות גלוי. הרווח של 650LP לתמונות נקבע על 7.50 B.</li>
	<li>באמצעות האפשרות סריקה בתוכנת ההדמיה הקונפוקלית, הזז את שלב המיקרוסקופ עד שהדגימה מובאת למוקד.</li>
	<li>נווט סביב הרקמה בכל המישורים וקבל תמונות בודדות או תמונות z-stack באמצעות תוכנת ההדמיה הקונפוקלית.</li>
	<li>לאחר השלמת ההדמיה, הסר את הדגימה מהתא. מניחים אותו בחזרה לתוך צינור מלא לחלוטין עם DBE ולאחסן ב RT במקום חשוך, רצוי מכוסה בנייר אלומיניום. הערה: ניתן טען מחדש ותמונה של דגימות כל עוד אות פלורסנס עדיין חזק.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction.">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).</li><li>Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+transgenic+rat+model+of+neuroHIV.">The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins,+Tat+and+gp120,+target+the+developing+dopamine+system.">HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system.</a> Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).</li><li>Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+and+cocaine+disrupt+dopamine+reuptake+and+medium+spiny+neurons+in+female+rat+striatum.">HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum.</a> PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry.">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Science Report. 8, 6152 (2018).</li><li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure.">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).</li><li>Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+distribution+of+ventral+striatal+neurons+projecting+to+the+mesencephalon+in+the+rat.">Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat.</a> Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).</li><li>Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+afferents+to+the+rat+dorsal+raphe+nucleus+demonstrated+by+retrograde+and+anterograde+tracing+methods.">Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.</a> Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).</li><li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braking+dopamine+systems:+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions.">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li><li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson's+disease.">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (11), (2019).</li><li>Ransohoff, R., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma.">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468, 253-262 (2010).</li><li>Rocha, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy:+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution.">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li></ol>

לאף אחד מהמחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

ניקוי רקמות מציע פתרון למגבלות של פרוטוקול IHC המסורתי. מדגם שקוף ממזער את הפיזור והספיגה של האור, המספק גישה אופטית ברמה התאית לרקמות שלמות18,19. טכניקות ניקוי רקמות הופכות רקמה לשקופה באמצעות התלזות, דה-צבע ופירוק הסתיידות עם ניהול ממסים. לאחר אינדקס שבירה של דגימת הרקמה תואם את האינדקס שבירה של מדיום ההדמיה שנבחר, המדגם ייראה שקוף לחלוטין וניתן לדמיין כראוי3. הפרוטוקול ההידרופובי הנוכחי מסיר מים מהרקמה בשלבי ההתייבשות הראשוניים, ובכך מפחית את פיזור האור. הרקמה מחלחלת במהלך טיפול מקדים כדי לאפשר חדירת נוגדנים עמוקה. רקמה שעברה את הפרוטוקול ניתן לטפל בקלות וניתן לדמיין אותה מספר פעמים. אם מאוחסן כראוי, רקמות עדיין יכול לספק תמונות עד שנה לאחר העיבוד הראשוני.
בפרוטוקול הנוכחי, אנו מיישמים טכניקת ניקוי רקמות הידרופובית על דגימות רקמת מוח של עכברוש F344/N ו- HIV-1 Tg כדי להכתים עבור TH, Iba1 ו- CTB. לאחר הסליקה, דגימות הרקמה צולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. לפרוטוקול הנוכחי יש מספר יתרונות על פני פרוטוקול הידרופובי אחר, כמו iDISCO4. ראשית, פרוטוקול iDISCO המקורי אומת לשימוש ברקמת עכברים, בעוד הפרוטוקול הנוכחי הוא קיימא ברקמת המוח חולדה. שנית, זמן הדגירה המותאם בכל שלב מאפשר להשתמש בטכניקה עבור מקטעי רקמות גדולים יותר. שלישית, כולל הסרום המתאים במהלך דגירה נוגדנים (בניגוד לשימוש בסרום כללי) מספק תמונות ברורות יותר לניתוח.
בעוד הפרוטוקול הנוכחי ניתן להתאמה בקלות כדי להתאים את הצרכים של שאלות מחקר בודדות, ישנם מספר שיקולים חשובים. הפרוטוקול לוקח, לכל הפחות, 26 ימים רצופים מתחילתם ועד סופם. אין להשאיר את המדגם בפתרון למשך זמן רב יותר ממה שצוין לעיל. המדגם יכול, עם זאת, להיות מאוחסן DBE בסוף הפרוטוקול לפחות 6 חודשים בבטחה עד הדמיה, אם כי מומלץ לדמיין בהקדם האפשרי. הזמינו תא מודפס בתלת-ממד שיתאים לדגימה בצורה נוחה בין שקופית המיקרוסקופ לכיסוי. כל פתרונות המלאי, מלבד פתרון 1, היו מעורבים יום של סכום שהיה מתאים לשימוש באותו יום. המדגם צריך להיות מועבר צינור חדש בכל פעם פתרון חדש הוא הציג כדי למנוע זיהום צולב. אם הצמיחה המיקרוביאלית מדאיגה, ניתן להוסיף נתרן אזיד לפתרון 2, פתרון 3, פתרון 4, פתרון הנוגדנים העיקרי, ולתמיסת הנוגדנים המשנית בריכוז של 0.02% בתמיסה הכוללת.
בסך הכל, הטכניקה הנוכחית היא הליך רב-תכליתי, קל מאוד ליישום ובעלות נמוכה התואם נוגדנים רבים. עם פרוטוקול זה כי הוא מאומת לעבוד הן F344 / N שליטה ו- HIV-1 Tg חולדות, שאלות מחקר חקירה חדשות רבות ניתן לענות.

מספר טכניקות לניקוי רקמות אומתו לשימוש במוח: הידרוג'ל, הידרופילי והידרופובי. טכניקות אלה שואפות להפוך רקמה לשקופה באמצעות התלזות, דה-צבע ופירוק באמצעות ניהול ממסים. לאחר אינדקס שבירה של דגימת הרקמה תואם את האינדקס שבירה של מדיום ההדמיה שנבחר, ניתן להשיג תמונה ברורה של המדגם. טכניקות מבוססות הידרוג'ל, כגון CLARITY, ביומולקולים מאובטחים ברקמה על ידי קישורם הידרוג'לים מבוססי אקריל, המונע נזק מבני ואובדן חלבונים1. עם זאת, טכניקות הידרוג'ל להשתמש כימיקלים קשים מאשר יש פוטנציאל לפגוע רקמות שבירות יותר, ודגימות רקמות צפופות יותר לא יכול להיות תואם פרוטוקול הידרוג'ל. טכניקות הידרוג'ל מסוימות עשויות לדרוש ציוד יקר או להוביל להרחבת רקמות. טכניקות הידרופיליות, כמו CUBIC, לשמר מבנה 3D באמצעות היווצרות של קשרי מימן בתוך הרקמה2. הרחבת רקמות יכולה להתרחש גם בפרוטוקול הידרופילי מסוים. יכולת הסליקה של טכניקות הידרופיליות לעתים קרובות אינה תואמת את היכולת שיש לטכניקות הידרופוביות, החשובה לרקמות צפופות ועבות יותר3.
טכניקות הידרופוביות הן בדרך כלל מהירות, אינן דורשות ציוד מיוחד, ומייצרות מדגם שקל לטפל בו ולאחסן. iDISCO היא טכניקה הידרופובית שמבטלת את ההתכווצות שיכולה להתרחש בפרוטוקול הידרופובי אחר. במקור, טכניקת ניקוי הרקמות iDISCO תוארה על ידי Renier et al.4 עבור העוברים ואיברים צפופים, מבוגרים של עכברים. טכניקה זו מסירה מים מהרקמה בשלב ההתייבשות הראשוני, ובכך מפחיתה את פיזור האור. הרקמה מחלחלת במהלך טיפול מקדים כדי לאפשר חדירת נוגדנים עמוקה. אלכסה פלור צבעים בספקטרום האדום הרחוק משמשים אימונולאבלינג כדי למנוע autofluorescence של הרקמה באורכי גל נמוכיםיותר 5. רקמה שעברה פרוטוקולי סליקה הידרופוביים ניתן לטפל בקלות וניתן לדמיין מספר פעמים בשל אריכות הימים של צבעי Alexa Fluor. אם מאוחסן כראוי, רקמות יכול לספק תמונות במשך חודשים עד שנה לאחר העיבוד הראשוני.
בפרוטוקול הנוכחי, נוגדן טירוסין הידרוקסילאז (TH), נוגדן Iba1, ו Cholera רעלן Subunit B (CTB) שימשו הן על שליטה זכרית ונקבה והן HIV-1 מהונדס (Tg) מוחות חולדה. חולדת HIV-1 Tg מחזיקה בשבעה מתוך תשעת הגנים המרכיבים את הגנום הנגיפי HIV-1, מה שמוביל למודל לא זיהומי של חשיפה ארוכת טווח לחלבון HIV-16,7,8. שינויים דופאמין הוכחו בעבר בחולדה HIV-1 Tg, ו- HIV-1 עצמו היא מחלה דלקתית, ולכן בחירת הנוגדנים הייתה רלוונטית לעיצוב הניסיוני9,10,11,12. CTB הוא נותב המתחבר לנוירונים באמצעות כריכת גנגליוסיד וניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר תחזיות חיוביות במוח. CTB שימש בעבר כדי ללמוד תחזיות מגרעין האקומבנס לאזור הסובסטנציה ניגרה, שני אזורים במוח המעורבים בכבדות עם מסלולים דופאמין13,14,15.
בפרוטוקול זה, TH ישמש סמן לייצור דופמין, ו Iba1 יסמן מיקרוגליה פעילה. נוגדן TH המשמש באופן סלקטיבי תוויות רצועה אחת בכ 62 kDa התואם טירוצין הידרוקסילאז. הנוגדן Iba1 מתאים לרצף מסוף קרבוקסי Iba1. שני הנוגדנים גדלו בארנב והיו פוליקלונליים. CTB ישמש למעקב מדרדר של נוירונים מאזור גרעין האקומבנס לאזור הסובסטנציה ניגרה. הפרוטוקול הנוכחי מציע גם קו מנחה להתאמת פרוטוקול iDISCO המקורי בשתי דרכים נפרדות: 1) הפחתה כוללת של כתמי הרקע על ידי שינוי ריאגנטים בסרום בשלבי החסימה, ו -2) שינוי קנה המידה של זמן הדגירה כך שיתאימו לדגימות רקמות גדולות יותר. בסך הכל, הפרוטוקול הנוכחי מספק ראיות מתמשכות לכך שטכניקות סליקה הידרופוביות אפשריות ברקמות המוח של החולדה, אין להן אינטראקציות מזיקות ניכרות עם חלבונים ויראליים HIV-1, והן תואמות לנוגדן TH, נוגדן Iba1 ו- CTB.

<table><tbody><tr><td>Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>C34775</td><td></td></tr><tr><td>DBE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DCM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997-100mL</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Chemical</td><td>G46-500</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32733</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma Life Science</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Acros Organics</td><td>41121-0010</td><td></td></tr><tr><td>Iba1 primary antibody</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-sil epoxy</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1l-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion machine</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td>mini pump variable flow</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-3KG</td><td></td></tr><tr><td>TH primary antibody</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue

שיטות ניקוי רקמות הידרופוביות ניתנות להתאמה בקלות, מהירות ובעלות נמוכה המאפשרות לחקור מולקולה של עניין בדגימות רקמות ללא לשינוי. הליכי אימונולאבלילינג מסורתיים דורשים חיתוך המדגם לחלקים דקים, מה שמגביל את היכולת לתייג ולבחון מבנים שלמים. עם זאת, אם רקמת המוח יכולה להישאר שלמה במהלך העיבוד, מבנים ומעגלים יכולים להישאר שלמים לניתוח. שיטות הסליקה שנקבעו בעבר לוקחות זמן משמעותי לנקות את הרקמה לחלוטין, והכימיקלים הקשים יכולים לעתים קרובות לפגוע בנוגדנים רגישים. שיטת iDISCO מנקה רקמות במהירות ובצורה מלאה, תואמת לנוגדנים רבים, ואינו דורש ציוד מעבדה מיוחד. טכניקה זו אומתה בתחילה לשימוש ברקמת עכברים, אך הפרוטוקול הנוכחי מתאים שיטה זו לחצי הכדורים של שליטה ומוחות חולדה מהונדסים. בנוסף לכך, הפרוטוקול הנוכחי מבצע גם מספר התאמות לפרוטוקול הקיים כדי לספק תמונות ברורות יותר עם פחות כתמי רקע. נוגדנים עבור איבה-1 ו טירוצין הידרוקסילאז אומתו בחולדה מהונדסת HIV-1 ובחולדות בקרה F344/N בשיטת ניקוי הרקמות ההידרופובית הנוכחית. המוח הוא רשת שזורה, שבה מבנים פועלים יחד לעתים קרובות יותר מאשר בנפרד זה מזה. ניתוח המוח כמערכת שלמה בניגוד לשילוב של חלקים בודדים הוא היתרון הגדול ביותר של כל שיטת ניקוי המוח הזו.

ניקוי מלא של חלקים גדולים של F344/N ו- HIV-1 רקמת מוח חולדה הושג באמצעות פרוטוקול ניקוי רקמות הידרופוביות זה שונה. איור 1 מציג תמונה קונפוקלית טיפוסית עבור TH באזור הסובסטנציה ניגרה. איור 1A מייצג כתמים צפופים וחיוביים. אזורים צפופים כגון אלה ניתן לנתח על ידי התמקדות דרך מישור "Z" כדי לאשר כתמים חיוביים מורפולוגיה תאים נכונה. איור 1B מייצג כתמים חיוביים דלילים, שניתן לזהותם על ידי המורפולוגיה הייחודית של תאי העצב TH. איור 1C מייצג רקמה שאינה מוכתמת באופן חיובי אך עדיין כהה עד בהירה עקב אות רקע. אזורים בתמונה המופיעים כשחרוקים לחלוטין מצביעים על היעדר רקמה באזור זה. אזורים שחורים לחלוטין בתמונה יכולים להיות על קצה המדגם, חור שנמצא במדגם, או רקמה כי הוא מחוץ לפוקוס.
איור 2A מראה מורפולוגיה אופיינית של נוירון חיובי TH בהגדלה של פי 20. תמונות קונפוקליות מוכתמות וממוקדות כראוי יציגו באופן אידיאלי פלואורסצנטיות בהירה ופריכה על רקע כהה. נוירון חיובי TH יש סומה גדולה (גוף התא) וכמה תהליכי הסתעפות16. איור 2B מציג מיקרוגליה מוכתמת של Iba1, שיש בה גופים של תאים קטנים ותהליכי הארכה קצרים יותר17. אישור של כתמים נאותים ומורפולוגיה של תאים צפויים הוא הצעד הראשון בהדמיה.
איור 3 משווה תמונה אידיאלית(איור 3A)לשלוש תמונות לא רצויות (איור 3B-D). איור 3A מראה כתמים חיוביים ובהירים על רקע בהיר וחשוך. ניתן להבחין בקלות בין כתמים חיוביים לרקע. איור 3B הוא דוגמה לתמונה ממוקדת בצורה לא נכונה עם יותר מדי רווח פלואורסצנטי. איור 3C מראה אות חיובי כוזב. כתמים בהירים שאינם בפוקוס עם שאר הרקמה הם חפצים ואין לראותם כאות חיובי. איור 3D הוא דוגמה לשימוש בסרום חסימה שאינו תואם לנוגדן המשני, כפי שהוצע בפרוטוקול iDISCO המקורי4. בתמונה זו, השימוש בסרום חמור לנוגדן משני המיוצר בעז יצר תמונה עם כתמי רקע גבוהים, אשר מטשטש את היכולת לזהות כראוי כתמים חיוביים.
איור 4A מראה כתמי CTB חיוביים במוח החולדה. הסיבים הארוכים והדקים הם תחזיות חיוביות לאורך המסלול הדופאמין. איור 4B ואיור 4C מראים colocalization של TH ו- CTB. באיור 4Bניתן לראות את ההזרקה באזור גרעין האקומבנס, המופיע כעיגול ירוק פלואורסצנטי בצפיפות. איור 4C מציג קולוקליזציה של TH ו-CTB באזור הסובסטנציה ניגרה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61821/61821fig01.jpg"> איור 1: תמונה קונפוצלית של דגימת רקמה מנוקה הידרופובית עם סמנים, הגדלה פי 4. (A)כתמי TH צפופים באזור הסובסטנציה ניגרה. (B)נוירוני TH דלילות הסמוכים לסובסטנציה ניגרה. (C)רקמה חסרה נוירוני TH חיוביים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61821/61821fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61821/61821fig02.jpg"> איור 2: מורפולוגיה אופיינית של נוירונים חיוביים TH (הגדלה של פי 20) ו-Iba1 positive microglia (הגדלה של פי 10). (A)שני נוירונים חיוביים TH מייצגים. (B)איבא1 מיקרוגליה חיובית. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61821/61821fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61821/61821fig03.jpg"> איור 3: תמונות קונפוקליות אידיאליות ועניות של רקמה מנוקה הידרופובית, הגדלה פי 4. (A)כתמי TH צפופים באזור הסובסטנציה ניגרה, בפוקוס נכון עם רווח פלואורסצנטי מתאים. (ב)תמונה ממוקדת וחשופה יתר על המידה. (ג)כתמים חיוביים כוזבים. (D)כתמי רקע גבוהים כתוצאה מציות לפרוטוקול iDISCO ללא משתנה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61821/61821fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61821/61821fig04.jpg"> איור 4: כולרה רעלן B תיוג לאורך המסלול דופאמין, הגדלה 4x. (A)תמונה קונפוצלית של כתמי CTB חיוביים. (B)תמונה חופפת של TH ו- CTB וגרעין accumbens הזרקת אתר. (C)Colocalization של TH ו- CTB באזור הסובסטנציה ניגרה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61821/61821fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
סרט 1: סרט תלת-ממדי של z-סריקה של המדגם בהגדלה 4x. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61821/3_D_video.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה. </a>

Watch this Scientific Journal Video about A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue at JoVE.com

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

כאן אנו מציגים שיטת ניקוי רקמות הידרופובית המאפשרת צפייה במולקולות יעד כחלק ממבני מוח שלמים. טכניקה זו אומתה כעת לשליטה F344/N ו- HIV-1 חולדות מהונדסות משני המינים.

שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

a-hydrophobic-tissue-clearing-method-for-rat-brain-tissue

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.9K Views.  University of South Carolina. כאן אנו מציגים שיטת ניקוי רקמות הידרופובית המאפשרת צפייה במולקולות יעד כחלק ממבני מוח שלמים. טכניקה זו אומתה כעת לשליטה F344/N ו- HIV-1 חולדות מהונדסות משני המינים.

Video: A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

ספיגה של 2 כלי השיט / תת לחץ דם: מודל עכברוש של איסכמיה המוח הגלובלית

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

Medicine

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

תמיכה מטבולית של טוחנות, חי ברקמות המוח במהלך רכישת מיקרוסקופ תהודה מגנטית

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Bioengineering

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) experiments. Determining the appropriate protocol to follow throughout the sample preparation process can be difficult as each step must be optimized to comply with the unique characteristics of the analytes of interest. This process involves not only finding a compatible matrix that can desorb and ionize the molecules of interest efficiently, but also selecting the appropriate matrix deposition technique. For example, a wet matrix deposition technique, which entails dissolving a matrix in solvent, is superior for desorption of most proteins and peptides, whereas dry matrix deposition techniques are particularly effective for ionization of lipids. Sublimation has been reported as a highly efficient method of dry matrix deposition for the detection of lipids in tissue by MALDI IMS due to the homogeneity of matrix crystal deposition and minimal analyte delocalization as compared to many wet deposition methods 1,2. Broadly, it involves placing a sample and powdered matrix in a vacuum-sealed chamber with the samples pressed against a cold surface. The apparatus is then lowered into a heated bath (sand or oil), resulting in sublimation of the powdered matrix onto the cooled tissue sample surface. Here we describe a sublimation protocol using 1,5-diaminonaphthalene (DAN) matrix for the detection and visualization of gangliosides in the rat brain using MALDI IMS.

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

סובלימציה של DAN מטריקס עבור איתור ויזואליזציה של Gangliosides רקמות מוח החולדה עבור MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that requires manual estimation. Here, we describe a simple, straightforward method for quantifying lesions and locating electrodes in the brain that is less laborious and yields more detailed results. Whole brains are stained with osmium tetroxide, embedded in resin, and imaged with a micro-CT scanner. The scans result in 3D digital volumes of the brains with resolutions and virtual section thicknesses dependent on the sample size (12&#8211;15 and 5&#8211;6 &#181;m&#160;per voxel for rat and zebra finch brains, respectively). Surface and deep lesions can be characterized, and single tetrodes, tetrode arrays, electrolytic lesions, and silicon probes can also be localized. Free and proprietary software allows experimenters to examine the sample volume from any plane and segment the volume manually or automatically. Because this method generates whole brain volume, lesions and electrodes can be quantified to a much higher degree than in current methods, which will help standardize comparisons within and across studies.

This article describes a straightforward method to prepare small animal brains for micro-CT imaging, in which lesions can be quantified and electrodes located with high precision in the context of the whole brain.

שיטה המבוססות על מיקרו-CT אפיון נגעים ואיתור אלקטרודות במוח בעלי חיים קטנים

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

Massive Pontine Hemorrhage by Dual Injection of Autologous Blood

We provide a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat. Rats weighing about 250 grams were used in this study. One hundred microliters of autologous blood was taken from the tail vein and stereotaxically injected into the pons. The injection process was divided into 2 steps: First, 10 &#181;L of blood was injected into a specific location, anteroposterior position (AP) -9.0 mm; lateral (Lat) 0 mm; vertical (Vert) -9.2 mm, followed by a second injection of the residual blood located at AP -9.0 mm; Lat 0 mm; Vert -9.0 mm with a 20-minute interval. The balance beam test, limb placement test, and the modified Voestch neuroscore were used to evaluate neurological function. Magnetic Resonance Imaging (MRI) was used to assess the volume of hemorrhage in vivo. The symptoms of this model were in line with patients with massive pontine hemorrhage.

We present a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat via dual injection of autologous blood.

דימום פונטין מסיבי על ידי הזרקה כפולה של דם אוטולוגי

We provide a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat. Rats weighing about 250 grams were used in this study. One hundred ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the morphology of processes and substructures within these neurons. As such, much of what is known about brain function has arisen alongside developments in imaging technologies that allow further insight into how neurons are organized and connected in the brain. Improvements in tissue clearing have allowed for high-resolution imaging of thick brain slices, facilitating morphological reconstruction and analyses of neuronal substructures, such as dendritic arbors and spines. In tandem, advances in image processing software provide methods of quickly analyzing large imaging datasets. This work presents a relatively rapid method of processing, visualizing, and analyzing thick slices of labeled neural tissue at high-resolution using CLARITY tissue clearing, confocal microscopy, and image analysis. This protocol will facilitate efforts toward understanding the connectivity patterns and neuronal morphologies that characterize healthy brains, and the changes in these characteristics that arise in diseased brain states.

Neuronal dendritic morphology often underlies function. Indeed, many disease processes that affect the development of neurons manifest with a morphological phenotype. This protocol describes a simple and powerful method for analyzing intact dendritic arbors and their associated spines.

הדמיה וכימות של דנדריטים עצביים שלמים באמצעות ניקוי רקמות CLARITY

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain cells and their interactions. Viral vector transduction enables the marking of diverse cell types in different fluorescence colors within the same tissue. Cells can be identified genetically by activity or projection. Using a modified CLARITY protocol, the potential sample size of astrocytes and neurons has grown by 2-3 orders of magnitude. The use of CLARITY allows the imaging of complete astrocytes, which are too large to fit in their entirety in slices, and the examination of the somata with all their processes. In addition, it provides the opportunity to investigate the spatial interaction between astrocytes and different neuronal cell types, namely, the number of pyramidal neurons in each astrocytic domain or the proximity between astrocytes and specific inhibitory neuron populations. This paper describes, in detail, how these methods are to be applied.

Combining viral vector transduction and brain clearing using the CLARITY method allows the investigation of a large number of neurons and astrocytes simultaneously.

חקירת אינטראקציה מרחבית בין אסטרוציטים לנוירונים במוחות מנוקים

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Extraction and Tissue Clearing Preparation of Mouse Brain-Spinal Cord Samples

Neuroscience research focused on the central nervous system necessitates a thorough understanding of various factors, including cell distribution, neuronal connectivity, and molecular dynamics. Traditional methodologies for investigating the entire brain and spinal cord often involve isolating, sectioning, and scanning tissue slices, followed by the labor-intensive process of three-dimensional image reconstruction. This conventional approach can be both time-consuming and cumbersome. Advancements in tissue clearing and whole-organ imaging techniques have revolutionized the analysis of the entire brain and spinal cord. To maximize the potential of these innovative methods, it is essential to extract and clear brain samples while maintaining their connection to the spinal cord. This protocol provides a detailed and systematic guide for preparing samples of the brain connected to the spinal cord, outlining the extraction and clearing procedures. By streamlining these processes, this approach significantly enhances experimental efficiency and data integrity, thereby fostering advancements in neuroscience research and enabling more comprehensive investigations into the complexities of the central nervous system.

This study presents a protocol for extracting and preparing cleared whole-brain and spinal cord samples with preserved fluorescent signals, enhancing experimental efficiency and data integrity to advance neuroscience research.

מיצוי וניקוי רקמות הכנת דגימות מוח-חוט שדרה של עכברים

Neuroscience research focused on the central nervous system necessitates a thorough understanding of various factors, including cell distribution, ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for a Rat Brain Tissue Sample

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61821/a-hydrophobic-tissue-clearing-method-for-rat-brain-tissue'>Source: Kirchner, K.N., et al.,&#160;A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp.&#160;(2020).</a>This video demonstrates the method of hydrophobic tissue clearing of a rat brain tissue sample. The sample is sequentially dehydrated in methanol, treated with a dichloromethane and methanol mixture to dissolve lipids and pigments, and transferred to dibenzyl ether for complete tissue clearing, enabling detailed imaging without thin sectioning.

Source: Kirchner, K.N., et al.,&#160;A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp.&#160;(2020).This video demonstrates the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Neurodegenerative Diseases

A Method for the Isolation of Neurovascular Units from Rat Brain

Source: Brzica, H., et al,. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57698">A simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the process of isolating brain microvessels from euthanized rats. It includes the dissection of the brain, cleaning of the tissue, and mechanical digestion, followed by repeated centrifugation to isolate the pure fraction of microvessels.

שיטה לבידוד יחידות נוירו-וסקולריות ממוח חולדה

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines. The procedural flow for the protocol ...