היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם שהוא מפחית את עלויות התיוג, משפר את מיצוי החלבון ומייצר נתונים באיכות גבוהה. היתרונות העיקריים של הפרוטוקול שלנו הם יעילות תיוג גבוהה עבור סוגים שונים של דגימות, השכפול שלה, ואת רכישת נתונים אמינים. לאחר בידוד דגימות רקמת שריר quadriceps מעכבר המתת דם על פי פרוטוקול מאושר IACUC, לשקול 10 מיליגרם של רקמת שריר ולהשתמש פינצטה כדי להפריד את סיבי השריר.
כדי ליצור lysate, להעביר את דגימת הרקמה המופרדת לתוך צינור שני מיליליטר המכיל 200 microliters של 1 מילימטר זירקוניה סיליקה חרוזים ו 500 microliters של חיץ תזה CHAPS. מניחים את הדגימות במשבש חרוזים ומבצעים שתי ריצות רציפות של 45 שניות. לאחר המחזור השני, כדי לשחרר את החלבון הקשור ל- DNA, sonicate המדגם 10 פעמים במשך 10 שניות לכל sonication ב משרעת 50% עם מרווחים של 30 שניות על קרח.
לאחר sonication האחרון, צנטריפוגה lysate ולהעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה חדש. להפחתה/alkylating טיפול ריאגנט, להעביר 200 מיקרוגרם של חלבון לכל מצב לתוך צינורות צנטריפוגה חדשים ולהשתמש חיץ תמוגה CHAPS טרי להביא את הנפח הסופי בכל צינור עד 100 microliters. לאחר מכן, מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של TCEP לכל צינור ודגירים את הדגימות ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
בסוף הדגירה, להמיס תשעה מיליגרם של iodoacetamide ב 132 microliters של 100 מילימולרי TEAB ולהגן על פתרון iodoacetamide מילימולרי וכתוצאה מכך מפני אור. לאחר מכן מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של iodoacetamide לכל מדגם ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. למשקעים מתנול/כלורופורם, הוסיפו 400 מיקרוליטרים של מתנול לכל 100 מיקרוליטרים של חלבון ומערבולת קצרה את הדגימות.
כדי לשלב את הנוזלים שהופקדו בצידי צינורות הדגימה, לזמן קצר צנטריפוגה הדגימות ולהוסיף 100 microliters של כלורופורם לכל צינור. לאחר מערבולת קצרה, במהירות צנטריפוגה הצינורות שוב כדי לאסוף את הנוזל בצדי הצינורות ולהוסיף 300 microliters של מים לדגימות. Vortex במרץ כדי להשיג פתרונות הומוגניים צנטריפוגה הדגימות במשך דקה אחת תחת אותם תנאי צנטריפוגה.
בסוף הצנטריפוגה, מעבירים את הצינורות בזהירות למדף מבלי להפריע לשכבות ומסירים בזהירות את העל-טבעי. הוסף 300 מיקרוליטרים של מתנול לשלבים הבין-תחתונים הנותרים ומערבולת הדגימות שוב במרץ. צנטריפוגה הדגימות במשך שתי דקות בזהירות לשאוף את supernatants.
ואז בעדינות לשאיף כמה שיותר נוזלים מכל מדגם ככל האפשר תחת זרם של אוויר עד כדורי הם רק קצת לח. להעריך את הידרציה כל שתי דקות במשך כ 10 דקות. במידת הצורך, כדורי ניתן לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד עיבוד נוסף.
כדי לעכל את החלבון, יש לעכל מחדש את גלולת ה-100 מיקרוליטר של מאגר תותבת TEAB ולהוסיף 100 מיקרוליטרים של פתרון אחסון טריפסין לתחתית בקבוקון זכוכית טריפסין 100 מיקרוגרם. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, מוסיפים 2.5 מיקרוליטרים של תווי טריים טריים של טריים ל-100 מיקרוגרם חלבון לכל דגימה ומדגירים את הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. לתיוג פפטיד, יש להמיס כל בקבוקון תג TMT של 0.8 מיליגרם עם 41 מיקרוליטרים של אצטוניטריל נטול מים לכל תג ולהדגיר את הרייג'נטים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם מערבולות מזדמנות תוך שמירה על התוויות מוגנות מפני אור.
בסוף הדגירה, צנטריפוגה קצרה את הבקבוקונים בזהירות להוסיף 41 microliters של reagent תווית TMT לכל מדגם 100 microliter עבור דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מרווה את התגובות עם תוספת של שמונה microliters של 5%hydroxylamine במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. ואז לפצל את הדגימות לאליקוטים שווים בצינורות צנטריפוגה חדשים לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס.
ברכישת נתונים מייצגת זו נותחו 39, 653 פפטידים בסך הכל, מהם 4, 457 היו שווים או גדולים משני פפטידים ייחודיים ו-3, 829 היו ביוני כתבים לכל הערוצים. ניתוק שינוי קיפול שימש כדי לקבוע את ההתפלגות היחסית של חלבונים ממחלות לעומת תאים בריאים עם 296 חלבונים של שפע נמוך משמעותית ו 108 חלבונים של שפע גבוה משמעותית שנצפו. ניתוח PANTHER הראה רשימה מסווגת של חלבונים המבוססת על שפע נמוך או גבוה יותר באופן משמעותי של תאים חיים המבוססים על תפקודם המולקולרי.
ניתוח מחרוזת של חלבונים של שפע נמוך או גבוה יותר באופן משמעותי זיהה עוד אינטראקציות מרובות קשרים חזקים בין חלבונים. ניתן לבצע שיטות נוספות לזיהוי אינטראקציות בין חלבון לחלבון, לסווג את האינטראקציות לפי קבוצות ולזהות את האינטראקציות במגוון מסלולים. טכניקות פרוטומיקה הן כלים רבי עוצמה בתחומי המחקר הביו-רפואי להבנת מנגנוני התפתחות המחלה על ידי מתן מידע מפורט על שפע החלבון.
