FPOP בתוך התא יחד עם ספקטרומטריית מסה היא טכניקה חדשה ורבת עוצמה המשמשת לחקר אינטראקציות חלבון חלבון ושינויים מבניים בחלבון בתאים חיים. עם FPOP בתא, אתה לא צריך לבודד חלבונים מעניינים, אבל יכול מעדיף ללמוד אותם בסביבות המקומיות שלהם. זה מועיל במיוחד עבור חלבוני קרום.
בשיטה זו, אתה יכול ללמוד שינויים במבנה ואינטראקציות חלבון חלבון במגוון מחלות, כולל סרטן והפרעות גנטיות, כך שאתה יכול להבין טוב יותר ולאפיין אותם. כדי להתחיל בהרכבה של מערכת הזרימה, השתמש באבן מחשוף כדי לחתוך את צינורות סיליקה התמזגו בגדלים המתאימים. לאחר מכן, מניחים שישה מגנטים גליליים קטנים במזרק אחד של 500 מיקרוליטר וממלאים את המזרק, מזרק מיקרוליטר שני 500, ושני מזרקים חמישה מיליליטר עם חיץ נדן.
לאחר הסרת האוויר, מניחים את המזרקים על משאבת המזרק ומהדקים את פקק משאבת המזרק כך שלמסע התא נותרו בערך 50 מיקרוליטרים כאשר המנוע נתקע. באמצעות מתאם פיתוי, לחבר שסתום ידני לכל מזרק ולהרכיב את צינורות סיליקה כפי שמודגם, הקפד להשחיל את התא בתוספת מי חמצן קו סיליקה דרך הצלב ולהכניס אותו ישירות לתוך קו סיליקה 450 ID. כאשר כל הצינורות מחוברים, מקם את מערכת הזרימה ליד לייזר ולהשתמש מצית לשרוף את ציפוי סיליקה על צינורות בקוטר פנימי 450 מיקרומטר כדי להפוך את החלון להקרנת לייזר.
מניחים בוחש מגנטי מעל מזרק התא המכיל את ששת המגנטים ומגדירים את משאבת המזרק ל-492.4 מיקרוליטר לדקה לקצב זרימה סופי של 1083.3 מיקרוליטר לדקה. מאגר זרימה דרך המערכת שלוש פעמים כדי לרוקן את המערכת, בדיקת כל חיבור עבור כל דליפות. השתמש בעדשה קמר כדי למקד את לייזר excimer על צינורות סיליקה.
כדי לבדוק את חלון ההקרנה, מניחים פיסת נייר קטנה מאחורי צינורות הסיליקה ומדליקים את הלייזר. לאחר מכן, למדוד את האזור שרוף מן ההקרנה ולהשתמש בחלון הקרנה וקצב זרימה כדי לחשב את תדר הלייזר הדרוש כדי לקבל שבר הדרה של אפס. כדי לאסוף את התאים עבור ההליך, לשטוף את התאים מ 70 עד 90% תרבות בקבוק T175 confluent עם פתרון מלח מתאים כיתה תאים.
תן שימוש חוזר בתאים ב-10 מיליליטר של חיץ לספירה ואיסוף התאים באמצעות צנטריפוגה. זה קריטי לספור את התאים כדי להבטיח שהם מספיקים לניתוח במורד הזרם, אבל לא יותר מדי כדי לגרום להם לצבור לסתום את מערכת הזרימה. לאחר מכן בצע שימוש חוזר בתאים בשתי פעמים 10 עד התאים השישיים למיליליטר של ריכוז חיץ נדן ו aliquot התאים לתוך נפח אחד 500 microliter לכל מדגם.
עבור FPOP בתא, מלא את שני המזרקים חמישה מיליליטר עם חיץ נדן טרי, מזרק 500 microliter המכיל את המגנטים עם aliquot אחד של תאים, ואת מזרק 500 microliter הסופי עם מי חמצן 200 מילימולר מוכן טרי. הפעל את המערבב המגנטי ואת ספייק ב 220 microliters של דימתיל סולפוקסיד לאליקוט אחד של Quench. לאחר ערבוב עדין, מניחים את Quench מאחורי מערכת הזרימה כדי לאסוף את הדגימות מוקרן ולהדליק את הלייזר.
לאחר שבע שניות, הפעל את מערכת הזרימה. לאחר שהדגימה מסתיימת זורמת, מכבים את הלייזר ומערבבים בעדינות את הרווה עם הדגימה שנאספה. לאחר מכן, מלא את כל ארבעת המזרקים במאגר טרי ורוקן את המאגר דרך מערכת הזרימה.
לאחר שהמערכת מסיימת את ריקון, לחזור על ההליך עם aliquot חדש של תאים ופתרונות ללא הקרנה כמו אין בקרת לייזר להסביר חמצון רקע בתוך התאים. בעוד המדגם הבא פועל, צנטריפוגה המדגם הראשון resuspend גלולה ב 100 microliters של מאגר תמוגה התא המתאים. לאחר מכן, להעביר את הדגימה לצינור microcentrifuge להקפאת פלאש בחנקן נוזלי.
לאחר שכל הדגימות סיימו לפעול, לפרק את מערכת הזרימה ולזרוק את צינורות סיליקה בשימוש. לאחר מכן, לנקות את כל החיבורים האחרים על ידי sonication במשך שעה אחת בתסכולת 50%water 50%מתנול. לאחר בידוד ועיכול החלבונים מהתא lysate על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, לנתח את התא מתעכל lysate על פי פרוטוקולים סטנדרטיים טנדם LCMS כדי להתאים את פרוטיום שינוי FPOP רחב.
לאחר מכן, לטעון את הנתונים לתוך תוכנה מתאימה לניתוח חלבון ולנתח את הנתונים נגד מסד נתונים חלבון רלוונטי ואת האנזים לעיכול הרלוונטי. לאחר סיום החיפוש הקבצים, לחשב את מידת חמצון FPOP על החלבון של עניין. הדמיית פלואורסצנטיות של תמונות מוערמות YZ אורתוגונליות מראה הפרדה ברורה של מאגר הנדן מתספורת התא כשהוא זורם מעבר לחלון הקרנת הלייזר.
ניתן ליצור מפות חום ממוצעות תלת מימדיות של מאגר הנדן או פתרון התא כדי להמחיש את הערבוב המינימלי של שני הפתרונות. השימוש במערכת זרימת תאים בודדים מגדיל את מספר החלבונים שעברו שינוי חמצוני פי 13. כדי לאשר שינוי של חלבונים של עניין בתוך התאים שלמים, הדמיה פלואורסצנטי יכול להתבצע לאחר טיפול מי חמצן הקרנה.
באמצעות ספקטרומטריית מסת טנדם, שינויים אלה יכולים להיות מקומיים עוד יותר לחומצות אמינו ספציפיות על חלבון. המשמרת שנצפתה בכרומטוגרמת היונים המופקת הזו מיתרגמת לשינוי בהידרופוביות הנגרמת על ידי מתונין מחומצן בפפטיד שונה. השוואת actin בתא שכותרתו על ידי טביעת רגל במבחנה מגלה רמות דומות של חמצון, המציין כי actin יש נגישות ממס דומה עבור מחקרים הן בתא והן במבחנה.
יתר על כן, השוואה של היקף החמצון הפוטכימי המהיר של החלבון של שינויים עניין לנגישות ממס, שאריות שכותרתו מחושב משני מבנים גבישי actin מדגים כי חמצון פוטוכימי מהיר בתא של חלבון העניין ביעילות בודק את הנגישות ממס של החלבון המונומרי. ישנם מספר צעדים נוספים שניתן לנקוט כדי להגביר את הזיהוי של שינויים FPOP בשפע נמוך יותר, כולל כרומטוגרפיה 2D, שבר תת תאי, וטכניקות מולטיפלקסינג פרוטומיקה. עם השימוש ב- FPOP בתא, אנו יכולים כעת לבצע ביולוגיה פרוטומיוסטרוקטורלית כדי לחבר טוב יותר מבני חלבון עם הפונקציה התאית.
בשל 248 אורך גל ננומטר הנדרש עבור FPOP, הקפד תמיד ללבוש משקפי מגן UV ובגדים נאותים, כדי למנוע חשיפה לא מכוונת לקרינה משתקפת או מפוזרת.
