אז המודל שלנו מאפשר מחקר של אפנון שלאחר שעתוק של תעתיק מסוים בתאי אפיתל מכתשי בתרבות הראשונית ואת התנאים הפיזיולוגיים והפתופיזיולוגיים שלהם. אז ההידור חולף של תאי אפיתל מכתשי ראשי יש השפעה מינימלית על פיזיולוגיה של התא ומטבוליזם, אשר מהווה יתרון ברור על פני פרוטוקולים קלאסיים באמצעות מעכבי שעתוק. עבור הדור של פלסמיד תגובה המבטא גן של עניין, רצף של הגן, ואתרי שיבוט מרובים של וקטור בלתי ניתן לעיכול יש לנתח כדי לזהות את רצפי הזיהוי באתרי שיבוט מרובים כי אינם נוכחים באופן פנימי בגן.
באמצעות פולימראז taq נאמנות גבוהה וטכניקות PCR חפיפה סטנדרטיות, לאגף את הגן של עניין עם שני אתרי זיהוי אנזים הגבלה נבחרים באמצעות פריימרים מעצב. רצף בקידוד אפיטופ ה- V5 במעלה הזרם של גן העניין חייב להיכלל כדי להבחין בין הביטוי של הגן המומר לבין ביטוי אנדוגני. מוטנטים יכולים להיווצר על ידי מחיקה רציפה כדי לחקור את ההשפעות של שלושה אזורים שונים שאינם תרגום על היציבות של mRNA של הגן באמצעות פריימרים הפוכים קידוד אתר polyadenylation כי בהדרגה מוחק את הקצה העיקרי של האזור לא מתורגם.
בסופו של דבר, הכנסת הגן של עניין יכול להיות מאושר על ידי ניתוח הגבלה. האוריינטציה הגנטית והיעדר מוטציות שעלולות להיות מוצגות במהלך rtPCR ניתן לאשר על ידי רצף. עבור transfection של סוג ריאה עכברוש ראשי שני תאי אפיתל מכתשית, לזרוע את התאים ב 1 פעמים 10 לתאים השישי לס"מ מרובע ב 100 מילימטר צלחות פטרי בנוכחות מדיום חיוני מינימלי מלא.
תרבות במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני עם לחות. למחרת, להוסיף 500 microliters של מדיום שלם ללא אנטיביוטיקה לכל באר של צלחת חדשה 12 גם לחמם מראש את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. במהלך הדגירה הזו, הוסיפו מיקרוגרם אחד של פלסמיד התגובה ומיקרוגרם אחד של וקטור רגולטורי לצינור אחד של 1.5 מיליליטר ל באר.
לשטוף את תאי האפיתל מכתב עם 10 מיליליטר ל הבאר של 37 מעלות צלזיוס PBS ללא סידן או מגנזיום ולטפל בתאים עם חמישה מיליליטר ל הבאר של 37 מעלות צלזיוס 0.05% טריפסין במשך שתיים עד ארבע דקות באינקובטור תרבות התא. כאשר התאים התנתקו, לנטרל את טריפסין עם 10 מיליליטר לתוך באר של מדיום שלם ללא אנטיביוטיקה ולאסוף את התאים לתוך צינור חדש 50 מיליליטר. לשטוף את המנה עם ארבעה מיליליטר של מדיום טרי כדי לאסוף את כל התאים הנותרים ולשסות את התאים על ידי צנטריפוגה.
תן שוב את גלולת במיליליטר אחד של PBS לספירה וצנטריפוגה של התאים שוב. תוסיפו את גלולת הכדור בצפיפות של ארבע כפול 10 לתאים השביעיים למיליליטר של מאגר ההתמשלות מחדש ותוסיפו ארבע כפול 10 לתאים החמישיים לכל צינור של פלסמיד וקטור עם ערבוב עדין. מניחים צינור אחד בהתקן האלקטרופוזיה וממלאים את הצינור ב-3.5 מיליליטר של חיץ אלקטרוליטי.
יש לדכא לחלוטין את הבוכנה כדי להכניס קצה אלקטרודה מצופה זהב לתוך פיפטה ולערבב בעדינות את תכולת הצינור. בזהירות שאפו את התאים עם פיפטה והכניסו את הפיפט לתחנת האלקטרופולציה עד שנשמע צליל נקישה. בחר את פרוטוקול האלקטרופורציה המתאים עבור תאי אפיתל מכתב ולחץ על התחל במסך המגע.
מיד לאחר transfection, להסיר את פיפטה ולהעביר את התאים לתוך באר אחת של צלחת 12 היטב מחומם מראש. כאשר כל התאים כבר electroporated וציפה, מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא, החלפת supernatant בכל באר עם מדיום שלם עם אנטיביוטיקה לאחר יומיים. ההצלחה של transfection יכול להיות מאושר על ידי הביטוי של EGFP כפי שנצפה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי או ציטומטריה זרימה באמצעות וקטור בקרה.
כדי לעכב את שעתוק של הגן של עניין, 72 שעות לאחר transfection להחליף את supernatant עם מיליליטר אחד לכל באר של מדיום שלם בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר של adoxycycline מוכן טרי. כדי להעריך את זמן מחצית החיים mRNA של הגן של עניין, להחזיר את הצלחת אינקובטור תרבות התא מ 15 דקות עד שש שעות. שטיפת באר אחת עם מיליליטר אחד של קרח קר PBS לפני lysing התאים עם 500 microliters של חיץ תזה מערכת מיצוי RNA פנול כלורופורם זמין מסחרית ורעידות עדינות בכל נקודת זמן ניסיונית.
לאחר מכן, לבודד את RNA על פי הוראות קיט ולקבוע את התשואה RNA וטוהר על ידי ספקטרופוטומטריה ב 230, 260, ו 280 ננומטר. כדי לקבוע את היציבות של RNA מבודד, ראשית לטפל מיקרוגרם אחד של RNA הכולל מכל מדגם עם RNase חינם DNase אחד כדי להסיר את כל עקבות DNA פלסמיד. השתמש בערכת סינתזת cDNA זמינה מסחרית עם תערובת של אוליגו dT פריימרים משושה אקראי כדי לשפר את יעילות שעתוק הפוך כדי להפוך לתמלל את ה- RNA הכולל מדולדל DNA לתוך cDNA על פי הוראות היצרן.
הוסף 180 microliters של ביולוגיה מולקולרית כיתה מים 20 microliters של תערובת התגובה לדלל את תגובת cDNA בריכוז של חמישה ננוגרם למיקרוליטר מיד לדלל את תערובת cDNA עם ביולוגיה מולקולרית מולקולרית טרייה כיתה מים כדי להגיע 1.25 ננוגרם לריכוז microliter. שלב חמישה מיקרוליטרים של תערובת מאסטר צבע ירוק סייבר עם 0.1 מיקרוליטר של מים כיתה ביולוגיה מולקולרית, 0.45 microliters של פריימר 7.5 מיקרומולרי קדימה, 0.45 microliters של 7.5 מיקרומולרים הפוך פריימר, וארבעה microliters של 1.25 ננוגרם למיקרוליטר של cDNA כדי לקבל תגובה כוללת של 10 מיקרוליטרים. מקם את הדגימות בתרמוציקלר qPCR והעצים את גן תג ה- V5 של עניין ו- tetrocycline transactivator מראש אמפליקונים באמצעות תנאי qPCR כפי שצוין וליצור עקומת התכה ברזולוציה גבוהה כדי להעריך את טמפרטורות ההיתוך הספציפיות של האמפליקונים הרצויים ולהבטיח היעדר פסגות אמפליקון רעש.
טכניקת אלקטרופוזיה זו מאפשרת קצב יעילות של 25 עד 30%transfection כפי שנצפה על ידי היחסים של תאי EGFP שזוהו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וציטומטריית זרימה. הטיפול בתאי אפיתל מכתב עם מיקרוגרם אחד למיליליטר של דוקסיציקלין אין השפעה משמעותית על הביטוי של אלפא ENaC mRNA אנדוגני בכל נקודת זמן במהלך תקופת הטיפול. באמצעות מערכת ביטוי פלסמיד מבוקרת שעתוק כפי שהודגם, אות V5 אלפא ENaC יכול להיות מנורמל על פי הטרציקלין transactivator אות מתקדם כדי לקבוע את היעילות של transfection באמצעות שיטת מחזור כימות דלתא כפולה.
זמן מחצית החיים של אלפא ENaC mRNA הוא עד שבע פעמים קצר יותר בנוכחות טטרציקלין מחוץ למערכת מאשר בנוכחות actinomycin D, המאשר כי actinomycin D מוביל לייצוב mRNA אלפא ENaC חפץ. כמו כן, cyclohexamide וגידול נמק גורם אלפא טיפול ירד באופן משמעותי את היציבות של התמליל בעוד lipopolysaccharides לא. שינויים משמעותיים באפנן של יציבות MRNA אלפא ENaC V5 יכול להיות המושרה בהתאם לאזורים שנמחקו וכללו של שלושת האזורים לא תרגום הממשלה.
בנוסף, ביטוי יתר של חלבונים קשירה RNA ספציפי מקטין את היציבות של 5-אלפא ENaC mRNA לעומת transfection עם pcDNA ריק שלוש פלסמיד. כלי זה יהיה שימושי עבור שאילתת תובנות חדשניות לתוך הרגולציה שלאחר שעתוק של גנים מרכזיים המעורבים לתוך הפונקציה של אפיתל מכתשי ואת התנאים הפיזיולוגיים או הפתולוגיים שלהם.
