פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לתרבת מושבות תאי גזע על הידרוג'לים עם שליטה מלאה הן על הנוקשות של ההידרוגל והן על הגיאומטריה של המושבות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים לתרבת מושבות תאי גזע בתנאים המחקים טוב יותר את הסביבה הפיזיולוגית מאשר פלסטיק תרבות רקמות. בעת ביצוע פרוטוקול זה בפעם הראשונה, הקפד ליצור כמה נוספים של כל חומר ולהשתמש ליגנד פלואורסצנטי, כך שתוכל לפתור ולייעל בכל שלב.
טכניקה זו כרוכה במספר שלבים הכרוכים במיקום מדויק של חומרים שונים. הרבה יותר קל להבין את ההוראות הכתובות לפרוטוקול הזה ברגע שראית אותו מבוצע. כדי להתחיל בהליך זה, לערבב בסיס PDMS עם סוכן ריפוי PDMS ביחס של 10 לאחד לפי משקל ומערבבים ביסודיות.
Degas תערובת זו ב desiccator במשך 30 עד 60 דקות או עד כל בועות האוויר מוסרים. לאט ובדרך שווה יוצקים את תערובת ה-PDMS על פני השטח של הוופל המוכן. הקש על המנה על משטח העבודה כדי לשחרר את כל בועות האוויר מפני השטח של הוופל.
אופים את PDMS ב 70 מעלות צלזיוס במשך שעתיים ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר מכן לחתוך את PDMS לתוך בערך 10 על 10 ריבועים מילימטר, כל אחד מכיל את התכונות עבור מצב ניסיוני יחיד. אלה יתייחסו אליהם כאל בולים לשארית הפרוטוקול.
לאחר מכן, לערבב בסיס PDMS עם סוכן ריפוי PDMS ביחס של שמונה לאחד לפי משקל, ומערבבים ביסודיות. Degas את התערובת ב desiccator במשך 30 עד 60 דקות או עד כל בועות האוויר מוסרים. לאחר מכן, לאט ובדרך שווה יוצקים את ה- PDMS לתוך צלחת נקייה של 100 מילימטר.
הקש על המנה על משטח העבודה כדי לשחרר בועות אוויר. אופים את PDMS ב 70 מעלות צלזיוס במשך שעתיים ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר. עבור כל בול שנוצר בעבר, לחתוך 15 על 15 ריבוע מילימטר של PDMS.
לוחות אלה יתייחסו ללוחות שטוחים לשארית הפרוטוקול. היפוך כל חותמת שנוצר על לוח שטוח של PDMS כך התכונות על הדוכן עבור במגע עם לוח שטוח של PDMS. לחץ בעדינות על החלק העליון של החותמת עם מדפים כדי להבטיח אפילו מגע.
לאחר מכן, מניחים טיפה קטנה של פולימר לריפוי UV בממשק העליון של כל זוג בולים לוח. הפולימר יהיה מרושע בין השניים על ידי מתח פנים בסיוע כוח המשיכה. מניחים טיפה קטנה של פולימר לריפוי UV סביב הקצוות של ממשק הבול והלוח.
פעולה זו יוצרת גבול שיחזיק את פתרון הליגנד. לאחר מכן מניחים בזהירות את החותמת וזוגות סטירה לתוך תיבת עיקור UV. השתמש בהגדרת צריכת החשמל סטרילית STR ולחשוף במשך 10 דקות.
לאחר מכן, הסר את הזוגות מתיבת הסטריליזציה של UV ולהשתמש בשני זוגות מדפים כדי להסיר בעדינות את החותמת תוך החזקת הלוח השטוח והסטנסיל שנוצר מן הפולימר UV לריפוי. באמצעות מדפים, להסיר בזהירות את הסטנסיל ולהפוך אותו כך פני השטח כי הוא במגע עם הלוח השטוח של PDMS פונה כלפי מעלה. מניחים את הסטנסילים ההפוכה בחזרה לתיבת הסטריליזציה של UV.
השתמש בהגדרת צריכת החשמל סטרילית STR ולחשוף במשך שלוש דקות. באמצעות מדפים, ממוקם בזהירות כל צד שטוח סטנסיל למטה על כיסוי שטף חומצה לוודא כי התכונות מרוכזות על החלקת הכיסוי. מניחים חתיכה קטנה של סרט מעבדה על גבי כל סטנסיל.
לחץ בחוזקה ובצורה שווה על הסטנסיל כדי ליצור מגע חזק בין הסטנסיל לכיסוי. מניחים את החלקות הכיסוי עם סטנסילים בצלחת. מניחים את המנה הזאת לתוך מנקה פלזמה ולהחיל פלזמה בה עוצמה גבוהה במשך 30 שניות.
לאחר מכן, פיפטה פתרון ליגנד על פני השטח של כל סטנסיל. עבור שבלונות שנעשו 10 על ידי 10 מילימטר בולים מרובעים, להחיל 100 microliters לסטנסיל. לאחר מכן, לעטוף את המנה המכילה את החלקות כיסוי בסרט מעבדה דגירה בארבע מעלות צלזיוס לילה.
ראשית, לשטוף את הכיסוי עם שבלון באמצעות מטליות כדי להטביע אותו בקצרה בצלחת המכילה PBS סטרילי. להטביע את הכיסוי עם שבלונה לתוך שלב שני של PBS לשטוף אותו שוב. הסר את הסטנסיל מפני השטח של כיסוי נזהר לא לשבור את הכיסוי.
לאחר מכן, בקצרה להטביע את הכיסוי בצלחת המכילה מים אולטרה-חמים כדי להסיר מלחים מן שטיפות PBS. לגעת בקצה של כיסוי כדי לנגב משימה עדינה כדי לפתיל משם מים עודפים. יבש את הכיסוי להחליק תחת גז אינרטי כגון חנקן.
לאחר מכן, להכין פתרון polyacrylamide כדי להשיג את גמישות הידרוג'ל הרצוי. עבור כל כיסוי בדוגמת, להכין glutaraldehyde מופעל התחתון מכסה את השפה עם רווח ממוקם על גבי. פיפטה בין 75 ל -150 מיקרוליטרים של פתרון פוליאקרילמיד למרכז כל כיסוי המופעל glutaraldehyde.
באמצעות מדפים, מניחים תבנית כדי לכסות להחליק על כל glutaraldehyde מופעל מכסה להחליק עם polyacrylamide ו spacer כך ליגנד בדוגמת פונה פתרון polyacrylamide. מניחים בזהירות כל כריך פוליאקרילמיד למחזיק כובע עם חוטים התואמים לצינורות תחתונים חרוטיים 15 מיליליטר. בורג צינור חרוט 15 מיליליטר התחתון לתוך כל מחזיק כובע להחזיק את כריכי polyacrylamide במקום.
צנטריפוגה לכריכים פוליאקרילמיד בצינורות בדליי נדנדה ב 200 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. מוציאים את הצינורות מהצנטריפוגה ומ מניחים אותם במדפים לצינור כדי לשמור על כיוון במשך 50 דקות נוספות כדי להבטיח פולמריזציה מלאה. לאחר מכן, להסיר את הכריכים מן הצינורות להטביע אותם PBS.
עוטפים את המנה בסרט מעבדה ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך שלוש שעות או בארבע מעלות צלזיוס לילה. לאחר מכן, השתמש אזמל מדפים כדי להסיר בזהירות את התבנית כדי לכסות את החלקות ואת הרווח מן כריך polyacrylamide בזמן שהוא נשאר שקוע PBS. מניחים כל כיסוי עם פוליאקרילמיד בדוגמת לתוך מחזיק כובע.
מקום של אטם על גבי החלקת הכיסוי סביב polyacrylamide שבו החלל היה ממוקם. בורג צינור חרוט 15 מילימטר מנוסר לתוך מחזיק הכובע, ויוצרים באר עם polyacrylamide בדוגמת בתחתית. הרכבות אלה משתלבות בארות של צלחת באר 12 סטנדרטית לטיפול קל.
בעת ביצוע טכניקה זו, השתמש ליגנד פלואורסצנטי כדי להבטיח את התבנית הרצויה נוצר על פני השטח של החלקת כיסוי זכוכית, והועבר בהצלחה אל פני השטח של הידרוג'ל polyacrylamide במהלך פולמריזציה. המדד האולטימטיבי להצלחה בשיטה זו הוא היכולת לתרבת hESCs בגיאומטריות הרצויות על הידרוג'לים בדוגמת. כאשר הם מתורבתים כמתוארים בפרוטוקול הטקסט, ה- hESCs מתרבים בדרך כלל כדי להשלים את הגיאומטריות עם הדוגמאות ב- 48 עד 72 שעות לאחר הסרתו המוחלטת של ה- Y27632 מהמדיה.
כיתת מושבות hESC בגיאומטריות מוגבלות על הידרוג'לים פוליאקרילמידים מאפשרת מדידה של כוחות המתיחה שנוצרו על ידי תאים באמצעות מיקרוסקופ כוח המתיחה. מדידות אלה נעשות על ידי הטמעה מיקרוספרות פלואורסצנטיות בהידרוגל והדמיה של המיקומים של חרוזים אלה לפני ואחרי זריעת hESCs. התמונות של עמדות חרוזים ניתן להשתמש כדי ליצור מפות של תזוזות חרוזים אשר ניתן להשתמש בהם לאחר מכן כדי לחשב את הלחצים המתיחה הבסיסית.
במושבות מעגליות של hESCs, הלחצים המתיחה הגדולים ביותר נמצאים ליד הקצה ההיקפי של המושבות, בעוד מרכז המושבות להציג לחצים מתיחה נמוכה אחידה. למרות ההפצות הלא אחידות שנצפו של לחצים המתיחה, hESCs מתורבתים כמו עיגולים בדוגמת בתנאי תחזוקה, להציג ביטוי אחיד של סמן pluripotency אוקטובר 3/4 ומולקולת הידבקות התא E-cadherin. טכניקה זו תאפשר לחוקרים לדגמן טוב יותר עוברים אנושיים באמצעות תאי גזע עובריים אנושיים שיובילו בסופו של דבר לתובנות חשובות על האופן שבו בני אדם מתפתחים.
הליך זה יכול להיות מותאם לכל יישום שבו חוקר שואף לתרבת תאים בגיאומטריות מוגדרות על הידרוג'לים רכים. הליך זה תואם לרוב החומצות הביוכימיות, ומאפשר לחוקרים לענות על שאלות לגבי האופן שבו דברים כגון גיאומטריית רקמות וכוחות שנוצרו על ידי תאים משפיעים על ביטוי החלבון ואיתות התאים. חוקרים רבים משתמשים כעת בתאי גזע עובריים אנושיים כדי לדגמן התפתחות אנושית מוקדמת.
טכניקה זו תאפשר לחוקרים לענות על שאלות חשובות אלה בתנאים המחקים טוב יותר סביבה פיזיולוגית.
