פרוטוקול זה חל על מגוון רחב של פרויקטים סינון שמטרתם לפתח מעכבי ATPase, או כמו בדיקות למחקר בסיסי או עבור תרכובות קליניות פוטנציאליות. שיטה זו עברה אופטימיזציה עבור יישומי סינון בעלי תפוקה גבוהה למחצה. זה גם תוכנן כדי למנוע כמה חפצים נפוצים וזה לא דורש טיפול בחומרים מסוכנים.
במעבדה שלנו השתמשנו בהסטה זו כדי לפתח מעכבי מיוסין II חדשים וספטיים שאינם שרירים לטיפול בהפרעת שימוש במתאמפטמין. בתיאוריה, שיטה זו יכולה בקלות להיות מיושמת על כל אנזימים המייצרים ATP. הדגמה חזותית מסייעת להבהיר את כל הפרטים הטכניים החשובים.
כדי להתחיל, להכין 4, 500 microliters של 20 פתרון אקטין מדולל micromolar עבור כל מיקרופלסטיק פוליסטירן שחור 384 היטב על ידי דילול פתרון מלאי actin מרוכז במאגר actin. מערבבים את הפתרון ביסודיות על ידי צינור למעלה ולמטה 30 פעמים כדי לשבור את תווי actin להפחתת צמיגות והטרוגניות. ואז צנטריפוגה הפתרון כדי להסיר את כל החלבון המזרז הנוכחי.
מעבירים בזהירות את העל-טבעי לצינור צנטריפוגה נקי. הכן תערובת אנזימים ראשית בצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מיליליטר עבור כל צלחת בדיקה על ידי שילוב של 3, 252.9 microliters של מאגר מיוסין עבור בדיקה מעורבים מיוסין שריר השלד II, 171.4 microliters של פתרון LDH, ו 171.4 microliters של פתרון PK. הכן תערובת מצעים ראשית בצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מיליליטר עבור כל צלחת על ידי שילוב של 162.1 microliters של ATP, 162.1 microliters של PEP, ו 324.1 microliters של פתרון NADH.
אין להוסיף actin בשלב זה, כדי למנוע צבירה ומשקעים. כדי ליצור דילול סדרתי של 1 ל-2 שלבים של NADH לכיול, הכינו שמונה צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. מערבבים 12.3 מיקרוליטרים של פתרון מלאי NADH עם 257.7 מיקרוליטרים של מאגר מיוסין בצינור הראשון כדי ליצור פתרון 250 מיקרומולרים.
ואז aliquot 135 microliters של חיץ מיוסין לתוך כל אחד משבעת הצינורות הנותרים. מעבירים 135 מיקרוליטרים של הפתרון מהצינור הראשון לצינור השני ומערבבים על ידי צינורות. חוזרים על הפעולה עד להגעה לצינור השביעי.
השתמש בצינור האחרון כבקרת NO-NADH עם מאגר בלבד. כלול תמיד פקדים חיוביים ושליליים על לוחות מורכבים, ודילול NADH לכיול על לוחות מים. פקדים אלה חשובים ביותר לזיהוי ממצאים במהלך ניתוח נתונים.
באמצעות פיפטה בת שמונה ערוצים, העבר 20 מיקרוליטרים של פתרונות הכיול NADH לשורה הראשונה במוליכים בצלחת בדיקה. עכשיו להוסיף 4.2 microliters של מיוסין שריר השלד II לתערובת האנזים. וורטקס בקצרה.
מוסיפים מיוסין לתערובת האנזים ממש לפני חלוקת. דגירה ארוכה של פתרונות מיוסין מדוללים עלולה לגרום לאובדן פעילות עקב משקעים, וכריכה לא ספציפית למשטחי פלסטיק. לטעון את תערובת אנזים מיוסין מוכן לתוך אחד המכולות מדגם של מתקן אוטומטי.
בצלחת, למעט השורה הראשונה, מחלקים 8.4 מיקרוליטרים של תערובת אנזימי המיוסין לכל באר של צלחת ההתרסה. לאחר מכן מניחים את צלחת ההתרשכות ואת הלוחית המורכבת על מיקומי כלי המעבדה של מערכת טיפול אוטומטית בנוזלים המצוידת בראש כלי סיכה 100 ננוליטר. לאחר מכן להפעיל את השיטה המתאימה בתוכנה כדי להעביר 100 nanoliters של פתרונות מן הלוח מורכב מוכן לצלחת ההתנסויות.
לאחר מכן, מניחים את צלחת ההתלהמה על שייקר מיקרופלסטיק כדי לנער במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ב 1, 200 סל"ד. הוסף 4, 052 microliters של פתרון actin צנטריפוגה לתערובת המצע ומערבולת לזמן קצר. כדי להתחיל את התגובה האנזימטית, לוותר על 11.6 microliters של תערובת מצע actin לתוך כל באר של צלחת מרשם באמצעות מתקן אוטומטי, למעט השורה הראשונה.
על שייקר מיקרופלסטיק, לנער את צלחת ההתבונן במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ב 1, 200 סל"ד. צנטריפוגה צלחת ההתחשמלות ב 101 פעמים g במשך 30 שניות. השתמש במסנן קריאה ברוחב 380 ננומטר, ברוחב 10 ננומטר וב-470 ננומטר, מסנן פליטת רוחב פס של 24 ננומטר בשילוב עם המראה הדיכרומטית של 425 ננומטר להמראה הדיקורית של ה- assays.
מטב את מספר ההבזקים, רווח הגלאי, מידות הלוח וגובה המדידה לפני הפעלת ההבזקים. הפעל את המדידה במצב ריכוז גבוה. ודא כי הטמפרטורה הפנימית של קורא הלוח התייצב ב 25 מעלות צלזיוס.
לטעון את הצלחת לתוך קורא הלוחות ולנער עוד 30 שניות כדי להפוך את הצורה של פני השטח הנוזלי דומה בכל באר ולאפשר את הצלחת להגיע לטמפרטורת המדידה. סרוק את הלוח במרווחים של 45 שניות והקליט פלואורסצנטיות NADH למשך 30 דקות. עם הנתונים המיוצאים, התווה את עוצמת הפלואורסצנטיות שנצפתה כנגד הזמן עבור כל באר.
בצע רגרסיה ליניארית פשוטה כדי לקבוע את השיפוע ואת היירוט של התגובות פלואורסצנטיות עבור כל באר. השיפוע פרופורציונלי לקצב צריכת NADH אשר יכול לשמש קירוב טוב מאוד של שיעור צריכת ATP. היירוט פרופורציונלי לריכוז NADH בתחילת המדידה.
לאחר מכן, לבנות עקומת כיול עבור NADH על ידי התוויית היירוטים שהושגו עבור השורה הראשונה של הלוח נגד הריכוז של NADH. היירוטים מעריכים את עוצמת הפלואורסצנטיות האמיתית בהתחלה עם הרבה יותר ביטחון מהממוצע של עוצמת הפלואורסצנטיות הגולמית שקוראת בהתחלה. בצע רגרסיה ליניארית פשוטה כדי להשיג את השיפוע ואת היירוט של קו הכיול NADH.
כאן, היירוטים מתארים את אות הרקע הפלואורסצנטי ללא NADH נוכח, בעוד המדרון מתאים לעוצמת הפלואורסצנטיות התיאורטית המופחתת של פתרון NADH טוחנת אחת. כדי להמיר שינויים פלואורסצנטיים לתעריפי צריכת ATP מחלקים את השיפוע של תגובת הפלואורסצנטיות המתקבלת לשאר בארות על ידי השיפוע של קו הכיול NADH. לאחר מכן, לתכנן את שיעורי צריכת ATP נגד הריכוז של המעכב.
כדי לקבוע את הקבועים המעכבים, השתמש בכל תוכנה סטטיסטית מתאימה המסוגלת להתאים עקומה לא ליניארית, כגון Origin 2017. בחר התאמה עקומה לא ליניארית כדי להתאים את נתוני תגובת המינון למשוואה ריבועית המתאימה למודל שיווי משקל מחייב אחד לאחד פשוט. Y הוא שיעור צריכת ATP.
Y-מינימום הוא שיעור צריכת ATP בהיעדר מעכב. Y-מקסימום הוא שיעור צריכת ATP תיאורטית ב 100% עיכוב. t ו- t הם הריכוז הכולל של אנזים מיוסין ומעכב, בהתאמה.
KI הוא הקבוע המעכב. במחקר זה, תגובות מיוסין שריר השלד והבי II ATPase הראו עקבות עוצמת פלואורסצנטיות ליניארית ללא קשר למיוסין בשימוש או נוכחות של מעכבים. שיעורי ATPase המופעלים על בסיס ואקטין הראו תלות ליניארית בריכוז של מיוסין שריר השלד או הלב II.A מקדם חלון ההקרנה או גורם Z של 0.78 הצביע על מבחן אמין עם בקרות חיוביות ושליליות מופרדות היטב.
Blebbistatin, para-Aminoblebbistatin, ו para-Nitroblebbistatin הראו עקומות תגובת מינון רגילות או מתחת לערכי המסון המדווחים שלהם. קבועים מעכבים עבור IIs מיוסין שריר הלב השלד נקבעו על ידי התאמת משוואה ריבועית המייצג מודל קשירה שיווי משקל פשוט לנתונים. עקבות עוצמת פלואורסצנטיות עבור blebbistatin שהושגו ב- ATPase assay באמצעות מיוסין שריר השלד II הראו אות נורמלי לירידה ליניארית בהתאם לכמות המעכב הנוכחי.
עם זאת, מעל המסיסות של blebbistatin עלייה בלתי צפויה האות נצפתה ככל הנראה בשל היווצרות של גבישי בליביסטטין בהירים. במקרה של פרה-ניטרובלביסטטין עם עקבות נורמליות של עוצמת פלואורסצנטיות גולמית, שיעורי התגובה שהושגו מעל מיסות סטה מעקומת תגובת המינון שנקבעה עקב משקעים. באמצעות שיטה זו, פיתחנו מעכבי מיוסין חדשים, חזקים וסלקטיביים שעשויים לשמש ככלים מדעיים במחקר בסיסי או כמועמדים ישירים בעתיד.
מומלץ תמיד להשתמש ATPase שונה או מבחן פונקציונלי אחר ספציפי האנזים של עניין להבחין בין להיטים חיוביים אמיתיים ושקריים. כל החלבונים קושרים משטחי פלסטיק. בעיה זו יכולה להשפיע מאוד על התוצאות, במיוחד אם החלבון קיים בריכוזים נמוכים.
תמיד להימנע טיפול נוזלי מיותר, ולהשתמש צינורות שאינם מחייבים. בדיקות ATPase חלופיות דורשות בדרך כלל טיפול בחומצה גופרתית, חומרים רעילים או חומרים רדיואקטיביים. לעומת זאת, בדיקת ATPase המקושרת ל-NADH דורשת רייגנטים ללא רעילות או רעילות נמוכה מאוד בלבד.
