פרוטוקול זה מתאים לייצור diterpenoids מטוהרים שניתן להשתמש בהם לניתוח במורד הזרם שונה והוא יכול להיות מותאם אישית עבור מגוון רחב של מטרות מטבוליט שונות. היתרון העיקרי של שיטה זו היא שזו שיטה פשוטה וזולים לייצר כמויות מיליגרם של מטבוליטים מיוחדים. על ידי החלפת הגנים והאנזימים המשמשים לביטוי שותף, ניתן לשנות שיטה זו כדי לייצר טרפנואידים אחרים, כולל מונוטרפנואידים ו sesquiterpenoids, כמו גם מחלקות מטבוליט אחרות כגון פלבנואידים.
עבור ייצור מטבולי diterpenoid וטרנספורמציה, להתחיל על ידי חימום תאי E.coli מוסמכים כימית על קרח. כאשר התרבות הפשירה, להוסיף 25 microliters של תאים מוכשרים לכל מבנה למיקרו-צינור 1.5 מיליליטר מקורר ולהוסיף 1 microliter של 100 ננוגרם לכל פתרון microliter של כל מבנה המשמש לביטוי שותף. הדגירה את תערובות על הקרח במשך 30 דקות עם ערבוב עדין כל 10 דקות על ידי גירוד הצינורות על פני מתלה microtube.
בסוף הדגירה, החום מזעזע את תערובות התאים ב-42 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת לפני שהוא מניח את התאים בחזרה על הקרח למשך שתי דקות נוספות לפחות. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של 37 מעלות צלזיוס SOC בינוני לצינורות. ולהדקר את התרבויות במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 200 סיבובים לדקה.
בסוף הדגירה, מוסיפים כ -10 חמוזי זכוכית autoclaved ו 100 microliters של תאים אחד 37 מעלות צלזיוס חימם צלחת אגר מרק lysogeny עם האנטיביוטיקה המתאימה. ולנער את הצלחת אופקית עם המכסה במקום כדי לפזר את התאים באופן שווה. לאחר מכן, בעדינות להקיש על גם לתוך מיכל פסולת ולהדגר את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה, צד משטח מצופה למטה.
למחרת, הסר את הצלחת מהחרם. הוסף 5 מיליליטר של מדיום מרק lysogeny מוכן טרי עם האנטיביוטיקה המתאימה אחד 15 צינור זכוכית סטרילי מיליליטר עם כובע פלסטיק נושם לכל תרבות 1 ליטר מתוכנן, ולהשתמש קצה צינור לבחור בודדים טרנספורמציה E.Coli מושבות מצלחת אגר. הוסיפו מושבה אחת שנבחרה לכל אחד מ-15 הצינורות המוכנים של מיליליטר וכסו כל צינור עם מכסה הפלסטיק הנשום הנלווה.
לאחר מכן, מניחים את התרבויות הקטנות E.coli כתרים ב 37 מעלות צלזיוס רועד אינקובטור במשך 12 עד 24 שעות. למחרת להוסיף 100 מיליליטר של 10x PBS ל 900 מיליליטר של מרק נהדר בבקבוק 1 ליטר לכל תרבות קטנה עם אנטיביוטיקה המתאימה. ומ מניחים את flasks ב 37 מעלות צלזיוס ו 140 סיבובים לדקה במשך כ 30 דקות.
כאשר המרק הנהדר חם, מוסיפים את כל נפח 5 המיליליטר של כל תרבות חיסון לבקבוק תרבות אחד של 1 ליטר לתרבות. ומ מניחים את הבקבוקים באינקובטור הרועד ב-140 סיבובים לדקה במשך כ-3 שעות. כאשר הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מגיע 0.6, להפחית את הטמפרטורה של החממה ל 16 מעלות צלזיוס.
לאחר החממה התקרר, להוסיף 1 מיליליטר של IPTG טוחן אחד, 1 מיליליטר של טרי מוכן 4 גרם לליטר ריבופלבין ו 1 מיליליטר של 150 גרם לליטר חומצה אמינו-לוולינית לכל תרבות. לייצור דיטרפנואידים, הוסיפו 25 מיליליטר של נתרן פירובט טוחן אחד לכל תרבות כדי להבטיח היווצרות מבשר מספקת. לאחר מכן, הדגירה את התרבויות ב 16 מעלות צלזיוס ו 140 סיבובים לדקה במשך 72 שעות, הוספת 25 מיליליטר של פירובט נתרן מדי יום לתרבויות המתאימות.
להפרדה וטיהור מטבוליטים, יש לאבטח משפך מפריד על מעמד טבעת במכסה המנוע של האדים. ושים מיכל פסולת מתחת למשפך. יוצקים 500 מיליליטר של פתרון 50/50 של אתיל אצטט והקסאן לתוך המשפך המפריד.
ולהוסיף 500 מיליליטר של תרבות הביטוי המשותף E.coli טרנספורמציה של עניין לתוך המשפך. מניחים את פקק הזכוכית על המשפך ומנערים את המשפך 5 עד 10 פעמים כדי לערבב את התרבות עם ממס החילוץ, לעתים קרובות פותחים את המשפך בעוד המשפך הפוך ומכוון אותו לתוך מכסה המנוע של האדים כדי לדגום את המשפך. לאחר סיבוב שני של רעידות ו degassing כפי שהוכח רק, מניחים את המשפך זקוף לעמוד הטבעת במשך כדקה אחת.
כאשר שכבת הממס העליונה נפרדה משכבת התרבות המים, הסר את הפורק ורוקן את שכבת ה- E.coli לתוך מקור פסולת, תוך שמירה על שכבת הממס בתוך המשפך. לאחר מכן, לחזור על החילוץ עם הנותרים 500 מיליליטר של התרבות באמצעות אותם 500 מיליליטר של ממס המשמש לחילוץ הראשון, לפני ניקוז הממס המכיל את המטבוליטים שחולצו לתוך בקבוקון נקי. כאן מוצג כרומטוגרם הספקטרומטריה של כרומטוגרפיה גז-מסה מייצגת של מוצרי אנזימים טיפוסיים שחולצו.
תוצרי לוואי קלים שנצפו בדרך כלל כוללים כלוראמפניקול ונגזרות אינדולה אוקסינדול ואינדול פיוואלדהיד. לאחר טיהור diterpenoid באמצעות כרומטוגרפיה עמוד סיליקה, שלוש תרכובות dolabralexin ניתן להשיג, כפי לכמת בהתבסס על עקומה סטנדרטית באמצעות sclareol diterpenoid. כרומטוגרפיה סיליקה הוא אידיאלי להשגת טוהר גבוה של תרכובות היעד.
מאז זה מאפשר הכנה פשוטה של אולפינים diterpene ונגזרות מחומצן ומסיר בקלות את oxindole זיהום גדול, אשר נשמר על מטריצת סיליקה. כמו כן, הביטוי השותף של הגנים מסלול טרפנואיד יכול לשמש כדי לייצר diterpenoids ב N.Benthamiana, וכתוצאה מכך הייצור של dolabradiene ו 15, 16 אפוקסידולברן. הממסים המשמשים במהלך החילוץ צריך להיות אופטימיזציה עבור תכונות כימיות פיזיות של מטבוליטים של עניין ולא חייב להיות מעורב עם מים כדי לשמור על שתי שכבות נפרדות.
בעקבות הליך זה, מטבוליטים מטוהרים יכולים לשמש לניתוח במורד הזרם, כולל ניתוח מבני וחומצות אנטיביוטיות. טכניקה זו אפשרה את הגילוי של diterpenoids הרומן, כולל אלה המוצגים כאן, המאפשר מטבוליטים אלה להיות מנותח עבור המבנה הכימי שלהם biactivies חדש. לנקוט אמצעי זהירות בעת שימוש בממסים אורגניים במשפך הפרדה.
הקפד תמיד להיפטר מפסולת ביולוגית בהתאם לתקני הבטיחות במעבדה שלך.
