התפשטות היא מדד חשוב לתפקוד התא. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לפתח בדיקה רגישה של התפשטות במעבדות שלהם ללא העלות הגבוהה של ערכות מסחריות זמינות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא נמנעת מטיפול קשה בתאים ו/או משימוש ברדיואקטיביות.
תדגים את הטכניקה הזו ויקי וונג, מנהלת המעבדה שלי. כדי לתבצר, הסר תאי שריר חלקים של כלי הדם מבקבוקון עם מדיית תאי שריר חלקה בסרום 2%fetal bovine וצלחת ב-20,000 תאים למיליליטר ב- DMEM בצלחת של 96 בארות. לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
הוסף 30 ננוגרם לכל טסיות דם מיליליטר נגזר גורם גדילה לשלוש עד שש בארות כמו שליטה חיובית כדי לעורר התפשטות. לאחר מכן הוסף PBS לאותו מספר בארות כמו פקד שלילי. דגירה במשך 72 שעות.
לדלל בעבר חמישה מלאי EdU מילימולארי אחד ולהוסיף שני microliters לכל באר במשך 24 השעות האחרונות של תקופת התרבות 72 שעות. שמור קבוצה אחת של שכפולים ללא EdU כדי לקבוע פלואורסצנטיות רקע ובוהו. עשרים וארבע שעות לאחר מכן, לתקן את התאים על ידי הסרת מדיה, ולאחר מכן הוספת 150 microliters לכל באר של 4% paraformaldehyde ו דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר.
מוציאים את הפרפורמלדהיד ומוסיפים 150 מיקרוליטרים של 1%TX-100 במים ל באר ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לשטוף שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את TX-100. כדי לזהות EdU משולב באמצעות פלואורסצנטיות, לעשות 10 מיליליטר של פתרון תיוג לכל צלחת 96 גם רק לפני השימוש על ידי הוספת reagents מפתרונות מלאי בסדר הנכון:20 microliters THPTA, 20 מיקרוליטר נחושת סולפט, חמישה מיקרוליטר פלואורסין picolyl-azide, ו 100 microliters נתרן ascorbate לתוך PBS עבור נפח כולל של 10 מיליליטר.
השלב הקריטי ביותר הוא להפוך את פתרון התיוג ממש לפני השימוש. הסר PBS מ בארות, להוסיף 150 microliters של פתרון תיוג לכל באר דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לזהות את כל הגרעינים, הוסף DAPI לכל באר ותמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי או קורא לוחות הדמיה.
כדי להימנע מספירה ידנית וכאשר קורא לוחות דימות אינו זמין, ניתן לשנות פרוטוקול זה לקריאת זוהר באמצעות HRP azide ומצע ELISA. כדי לזהות את EdU באמצעות זוהר, הכינו תחילה מלוחים עם מאגר טריס עם 0.1%polysorbate 20. לאחר מכן הוסיפו 150 מיקרוליטרים של חיץ חסימה לכל באר ודגירה במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הסרת מאגר החסימה, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 200 microliters של PBS. כדי לזהות EdU משולב, תחילה להכין 10 מיליליטר של פתרון תיוג לכל צלחת 96 באר על ידי הוספת reagents מפתרונות מלאי בסדר הנכון. ראשית, 20 microliters THPTA, אז 20 מיקרוליטר נחושת סולפט, חמישה microliters ביוטין picolyl-azide, 100 microliters נתרן אסקורבאט לתוך PBS עבור נפח כולל של 10 מיליליטר.
לשטוף בארות חמש פעמים שלוש דקות עם 200 microliters של TBST עם רועד. מרווה פרוקסידס אנדוגני עם 150 מיקרוליטרים של 0.3% מי חמצן במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת מי חמצן, לשטוף חמש פעמים שלוש דקות עם 200 microliters של TBST עם רועד.
הוסף 50 microliters של peroxidase סטרפטבידין-חזרת מדולל ב TBST לכל באר דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לשטוף חמש פעמים שלוש דקות עם 200 microliters של TBST עם רועד. הוסף 50 microliters של מצע ELISA chemiluminescent לכל באר ולקרוא מיד קורא צלחת מסוגל לזהות זוהר.
למרות גרעיני פלואורסצנט ניתן לזהות על ידי קורא לוחיות פלואורסצנטיות סטנדרטי, באמצעות פרוטוקול luminescence, הסריקה פלואורסצנטי מומר קריאה נוזלי הומוגנית זוהה עם peroxidase סטרפטבידין חזרת ומצע ELISA סטנדרטי. היתרון של שיטה זו בהשוואה לקריאה פלואורסצנטי הוא קריאה הומוגנית יותר ואת הצלחת ניתן לקרוא בשניות כפי שניתן לראות כאן כאשר התפשטות של VSMC בתגובה PDGF נמדד. החיסרון הוא שהרקע גבוה יותר מאשר עם פלואורסצנטיות, ולכן פקדים שליליים נוטים להיות גבוהים יותר.
בניסיון להקטין את השונות, התוצאות נרמלו לספירת תאים ראשונית. עם זאת, בקבוצה נפרדת של ניסויים, הוכח כי שיטה זו אינה רגישה מספיק כדי לזהות הבדלים קטנים במספרי התאים. הדרך היעילה והמדויקת ביותר לספור תאים חיוביים וסה"כ EdU היא באמצעות קורא לוחות הדמיה.
אם סוג זה של קורא לוחות אינו זמין, ספירה ידנית תניב גם תוצאות מדויקות. בעת השוואת שתי שיטות אלה, הספירה הידנית החיובית של EdU הייתה זהה לספירה האוטומטית וכך גם סך הספירות הבלתי-פתורות. היתרון של שתי שיטות אלה הוא הראות של התאים להיספר, דיוק משופר, כי כתמים לא ספציפיים של פסולת ניתן לראות ולהימנע.
החיסרון העיקרי בשיטת הספירה הידנית הוא זמן. זכור להפוך את פתרון התיוג טרי ממש לפני השימוש ולהוסיף את החומרים בסדר המסופק בפרוטוקול הכתוב. אם עוצמת הכתם עמומה, נסו להתאים את הכלאטור ליחס נחושת.
זכור כי paraformaldehyde הוא רעיל. זה צריך לשמש ברדס אדים בעת לבישת כפפות. ההליך עצמו אינו קשה אך ייתכן שיהיה צורך לייעל אותו על ידי התאמת כלטור ליחסי נחושת בתסייגות.
בנוסף, ניתן להתאים את זמני הדגירה ואורך הטיפול ב- EdU בהתאם לסוג התא ולשאלה הספציפית שנשאל. טכניקה זו תואמת את פני התא ואת הכתמים תאיים, כך המאפיינים של תאים מתחלקים ולא מתחלקים ניתן לקבוע. למרות נפוץ למדוד התפשטות, כימיה לחץ יכול לשמש גם עבור תיוג מטבולי של RNA, חלבונים, חומצות שומן ופחמימות.
אם היעד המטבולי של עניין הוא על פני השטח של התא, תאים חיים ניתן לסמן.
