RNA immunoprecipitation במשולב ואחריו רצף, או RIPiT-Seq, היא שיטה לזיהוי אילו אזורים של RNA מאוגדים על ידי זוג מסוים של חלבונים מחייבים RNA. היתרון הייחודי ביותר של RIPiT הוא היכולת שלה למקד שני חלבונים שונים בשני טיהורים. זה מספק דרך רבת עוצמה להעשיר עבור קומפלקס חלבון RNA ברור קומפוזיציה של קומפלקסים אחרים.
כמו כן, RIPiT-Seq הוא עצמאי UV-crosslinking, והוא יכול להיות מיושם על חלבונים רבים לפעול על RNA מבלי לחייב אותו ישירות. בעוד שיטה זו אינה חלה ישירות לכיוון טיפול או אבחון, חלבונים מחייבים RNA ועיבוד RNA קושרו עם מספר מחלות כמו נוירופתיות וסרטן. RIPiT-Seq מספק כלי לחקר פונקציות של חלבונים מחייבים RNA הקשורים למחלות.
RIPiT-Seq דורש מערכת שבה חלבון מתויג אפיטופ יכול להתבטא. הוא נבדק רק בתאי HEK293, והוא נוח ביותר לתרבות התאים. עם זאת, כעת עם היכולת שלנו לתייג חלבונים באמצעות CRISPR, RIPiT-Seq יכול להיות ישים למערכות מודרניות מגוונות.
ההצלחה של RIPiT תלויה בשני immunoprecipitations יעיל, ולכן זה יהיה קריטי כדי לייעל את תנאי immunoprecipitation עבור הנוגדן בשימוש. כמו כן, עבודה עם RNA דורשת אמצעי זהירות נאותים, ולכן ריאגנטים ללא RNase יש להשתמש במהלך ואחרי מיצוי RNA. הפגנת ההליך תהיה לורן וודוורד, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי.
התחל על ידי שטיפת תאים monolayer בעדינות עם 15 מיליליטר של PBS מקורר לכל צלחת 15 ס"מ. ואז לגרד את התאים לתוך 30 מיליליטר של PBS ולאסוף אותם בצינור חרוט 50 מיליליטר. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 400 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, ולהשליך את העל טבעי.
הוסף ארבעה מיליליטר של חיץ תות תותים היפוטוני קר כקרח ולהשתמש פיפטה P1000 כדי להשעות מחדש את התאים. מעבירים את הביסאט לצינור של חמישה מיליליטר ומדרגים על קרח למשך 10 דקות. מניחים את הlysate באמבט קרח ו sonicate על פי הוראות כתב היד.
לאחר מכן מוסיפים 108 מיקרוליטרים של חמישה נתרן כלורי טוחן כדי להתאים את ריכוז המלח ל 150 מילימולר. לאחר מכן, צנטריפוגה lysate ב 12, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאסוף 20 microliters של supernatant לניתוח כתם מערבי. טרום שטיפה FLAG agarose חרוזים על פי הוראות כתב היד ולהחיל על טבעי שנותרו 750 microliters של חרוזים בצינור חמישה מיליליטר.
דגירה חרוזי דגל agarose עם תמצית התא במשך שעה עד שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין. לאחר הדגירה, גלולה את חרוזים על ידי צנטריפוגה ב 400 גרם במשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס, ולאסוף 20 microliters של supernatant לניתוח כתם מערבי. השליכו את העל-טבעי הנותרים ושטפו את חרוזים על-ידי שימוש חוזר בהם בארבעה מיליליטר של חיץ שטיפת ISO.
גלולה את חרוזים שוב ולהסיר את על טבעי. לדלל RNase אני ב 750 microliters של מאגר לשטוף iso על פי הוראות כתב יד, ולהוסיף אותו גם דגל agarose חרוזים. הדגירה את התערובת בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין, ולאחר מכן גלולה את חרוזים על ידי צנטריפוגה.
לאסוף 20 microliters של על טבעי לניתוח כתם מערבי, ולהשליך את השאר. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים עם מאגר לשטוף iso כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, בצעו אלוטיון אהדה על ידי הוספת 375 מיקרוליטרים של חיץ אלוטציה לחרוזים, וטלטלו את התערובת בעדינות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים.
לאחר הדגירה, גלולה את חרוזים ולאסוף aliquot 15 microliter של elution לניתוח כתם מערבי. בזמן שאלוטיון הזיקה בעיצומו, בצעו התייחדות נוגדנים של חרוזים מגנטיים. התחל על ידי שטיפת 50 microliters של חרוזים מגנטיים במיליליטר אחד של חיץ שטיפת iso.
תוסיפו את הצפרוזים ל-100 מיקרוליטרים של חיץ ההטיה ותוסיפו את הכמות המתאימה של נוגדנים. לאחר מכן, הדגירה את חרוזים לפחות 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את חרוזים מגנטיים פעמיים עם חיץ ההטיה ולחדש את חרוזים ב 375 microliters של מאגר דילול RIPiT.
לאחסן את חרוזים על קרח עד immunoprecipitation. יש למרוח את אלוטת הזיקה של FLAG על חרוזים מגנטיים מקובצים בנוגדנים ולהדגירה עם ערבוב עדין למשך שעה עד שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. ללכוד את חרוזים מגנטיים עם מגנט ולאסוף 15 microliters של על טבעי לניתוח כתם מערבי.
לאחר מכן, לשטוף את חרוזים שבע פעמים עם חיץ לשטוף iso. המשך עם elution denaturing על ידי שימוש חוזר חרוזים מגנטיים ב 100 microliters של חיץ מדגם ברור דגירה ההשעיה על הקרח במשך 10 דקות. במהלך הדגירה, מעת לעת להעיף את חרוזים כדי להשתמש בהם שוב.
ללכוד את חרוזים מגנטיים על מגנט ולאסוף 15 microliters של אלוט לניתוח כתם מערבי. העבר את האלוטיון הנותר לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. כדי לחלץ את ה-RNA, הוסיפו 320 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase ו-400 מיקרוליטרים של אלכוהול איסואמיל פנול-כלורופורם לאלוציון RIPiT.
Vortex את התערובת ולאחר מכן צנטריפוגה זה ב 12, 000 גרם במשך חמש דקות. לאסוף 350 microliters של השלב הממימי לתוך צינור נפרד. מוסיפים נתרן אצטט, מגנזיום כלורי, גליקוגן ואתנול לדגימה שנאספה ומדגרים את התערובת בן לילה ב-20 מעלות צלזיוס שליליות.
למחרת, גלולה RNA על ידי צנטריפוגה ב 12, 000 גרם במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולשטוף אותו 70% אתנול. לאחר שטיפת אתנול, לטפל RNA עם T4 פולינוקלאוטריד קינאז, או PNK, ללא כל ATP, ולבצע טיהור פנול-כלורופורם על פי הוראות כתב היד. יש לתפוש מחדש את ה-RNA הנקי ב-4.5 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase.
כדי לכמת את תפוקת ה-RNA, יש לכמת את ה-RNA עם PNK ו-32P עם תוויות ATPs בהתאם לכיווני כתב היד. השתמש בסולם DNA לטווח נמוך ואוליגו סינתטי 20 עד 40 נוקלאוטיד לתקני גודל וכמות. פתור את ה- RNA המסומן בג'ל 26%urea-polyacrylamide.
מייבשים את הג'ל לפי הוראות כתב היד וחושפים את הג'ל לזרחן עד לזיהוי אות הולם. טכניקה זו שימשה כדי לחקור את האינטראקציות של מתחם צומת אקסון או EJC. ניתוח כתם מערבי של חלבונים מטוהרים מכל שלב עיקרי בהליך RIPiT מראה כי EJC מטוהר מכיל הן EIF4A3 ו MAGOH.
הפקד השלילי, HNRNPA1, אינו מזוהה באלוטיון. עוצמת אות טביעת הרגל של RNA תואמת לכמות האינטראקציה של חלבון RNA. טביעת רגל חזקה יותר נצפתה כאשר RIPiT בוצע על תאים שטופלו puromycin, אשר מגביר את התפוסה EJC על RNA.
כדי להבטיח שה-RIPiT היה יעיל, חשוב לבדוק את היעילות של ה-IP על ידי כתם מערבי. חשוב גם להעריך את כמות ואיכות ה-RNA לפני שתמשיך ברצף עמוק. בשנת 2018, מעבדת סינג השתמשה בהצלחה בטכניקה זו כדי לטהר שתי וריאציות שונות קומפוזיציה של קומפלקס צומת אקסון ולזהות דפוסי איגוד RNA.
אם החוקרים בוחרים לזהות עקבות RNA עם אוטוביוגרפיה, יש לעקוב אחר כל נהלי הבטיחות והפרוטוקולים המתאימים לקרינה.
