הפרוטוקול שלנו מספק שיטה פשוטה לתרבות תאים תלת-מימדית והוא נוח מאוד לניתוח במורד הזרם. זה מקל על הערכה של דגימות חולים הטרוגניים ותגובות התרופה הספציפיות שלהם. היתרון של טכניקה זו הוא כי כדוריות יכול להיווצר מספרי תאים קטנים, המאפשר הן שימור של דגימות ראשוניות נדירות, הקרנת תפוקה גבוהה עבור תגובות תרופות ספציפיות למטופל.
מודל טיפה תלויה יוצר סביבה פיזיולוגית עם דיפוזיה תרופה 3D עושה תגובות המתאימות לשלב הגידול. זה מאפשר פיתוח של טיפולים ממוקדים וטיפולים ספציפיים למטופל. שיטה זו אידיאלית לחקר סרטן השחלות, הטרוגניות ופיתוח עמידות לכימותרפיה.
עם זאת, זה יכול לשמש גם כדי ללמוד סרטן אחרים ואוכלוסיות תאים עמידים לתרופות. כאשר ציפוי כדורי עופרה, חשוב pipette כרכים מדויקים. זה מבטיח עקביות בין כדוריות.
הספירואידים וה טיפות שלהם הם שבריריים מטבעם ואבד בקלות ללא טיפול נאות, ולכן נראה כיצד כראוי צלחת, לשמור ולנתח צלחת טיפה תלויה. הוכחת הליך זה יהיה מייקל ברגנזר, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלנו. התחל על ידי מילוי כל באר של צלחת שש באר עם ארבעה עד חמישה מיליליטר של מים deionized autoclave וכריך צלחת טיפה תלויה בין המכסה לתחתית הצלחת.
הוסיפו 800 עד 1000 מיקרוליטרים של מים סביב שפת צלחת הירידה התלויה כדי לספק סביבה לחה ולמזער את האידוי. לאחר מכן, לאסוף תאים 2D גדל על ידי ניתוק אותם עם טריפסין, ולאחר מכן הוספת שישה או שמונה מיליליטר של בינוני המכיל FBS. שאף את התאים עם פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר, והפקיד אותם בצינור חרוט 15 מיליליטר.
השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים. מכינים את השעיית התא לפי הוראות כתב היד, ומערבבים בעדינות עם הפיפיט כדי להבטיח הפצה הומוגנית. מניחים את קצה פיפטה באר בזווית של 45 מעלות ו pipette 20 microliters של השעיה לתוך כל טיפה תלויה היטב.
מניחים את המכסה של צלחת שש בארות בחזרה על ולהשתמש ברצועה תרמופלסטית מתוחה כדי לאטום את הקצוות. אינקובט באינקובטור פחמן דו חמצני סטנדרטי לח להאכיל את הטיפות התלויות כל יומיים עד שלושה ימים על ידי הוספת שניים עד שלושה microliters של תרבות התא בינוני לכל באר המכילה ספרואיד. כדי לכמת את התפשטותם ואת יכולת הקיום של התאים, הוסיפו שני מיקרוליטרים של פתרון מסונן המבוסס על רסזורין לבאנות המיועדות לניתוח התפשטות ולטוג על פי כיוון כתב היד.
לאחר תקופת הדגירה, לפתוח את כריך טיפה תלויה ארון biosafety ולהביא את צלחת 384 גם עם המכסה עדיין במקום לקורא צלחת. מניחים אותו קורא הלוח ולקרוא את הצלחת. שמור את הניסוי בחלון המוקפץ וייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני.
מחזירים את הצלחת לבסיס שש בארות ומ מניחים אותה באינקובטור. לאחר שכל נקודות הזמן נקראו במשך היום, סותם מחדש את הצלחת לפני הדגירה. כדי להכין כדוריות לניתוח ציטומטריה זרימה, להשתמש פיפטה 1000 microliter לאסוף אותם מכל באר ולהפקיד אותם לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר עבור disaggregation.
מתלי תא Aliquot לתוך חמישה צינורות מיקרו צנטריפוגה כך שכל צינור מכיל לפחות 50, 000 תאים. צנטריפוגה הצינורות ב 400 פעמים G במשך חמש דקות במיקרוצנטריפוגה, ולאחר מכן שאף את כדורי supernatant ולהשעות מחדש ב 100 microliters של מאגר Aldefluor. תייג את הצינורות לפי הוראות כתב היד.
הוסף 0.5 מיקרוליטרים של נוגדן ISOTYPE APC לצינור ISO של APC ומיקרוליטר אחד של נוגדן CD133 לצינור ALDH CD133. לאחר מכן הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של רגנט DEAB ו-0.5 מיקרוליטרים של ALDH לצינור DEAB ומיקרוליטר אחד של ALDH לצינור ALDH CD133. מערבולת כל הצינורות במשך כמה שניות ו דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות.
לאחר הדגירה, מערבולת כל הצינורות שוב צנטריפוגה אותם ב 400 פעמים G במשך חמש דקות. סמן את צינורות FACS לפי הוראות כתב היד ומלא מיכל קצף מבודד בקרח. שאף את העל-טבעי מצינורות המיקרוצנטריפוגה.
לאחר מכן השהה מחדש את הפקד שאינו מזוהם ב- 400 מיקרוליטרים של מאגר FACS ואת שאר התאים ב- 400 מיקרוליטרים של מאגר DAPI של FACS. מניחים את הצינורות על הקרח עד שהם יכולים להיות מנותחים על ציטומטר זרימה. השתמש FlowJo כדי לנתח את הנתונים מן ציטומטר הזרימה.
לחץ פעמיים על הקובץ שאינו מזוהם והגדר את ציר ה- Y לצד גובה הפיזור או SSCH ואת ציר ה- X כדי להעביר גובה פיזור או FSCH. לחצו על הלחצן T שלכל ציר כדי להתאים את קנה המידה ולהגדיל את ההפרדה בין אוכלוסיות תאים שונות. לאחר מכן, לחץ על כפתור גת מצולע, לצייר שער מצולע סביב אוכלוסיית התא ולתייג את התאים האוכלוסייה.
לחץ פעמיים על אוכלוסיית התא בסביבת העבודה ולאחר מכן שנה את ציר FSC לרוחב FSC ואת ציר ה- SSC לגובה FSC. בחר את שער המלבן כדי לצייר מלבן רק סביב אוכלוסיית התאים הצפופה השמאלית ביותר, המשתרעת על-פני ציר Y כולו. סמן את השער הזה בתאים בודדים.
לאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני והעתק תאים אלה בשער התאים הבודדים המקוננים והדבק אותם תחת כל דוגמה בסביבת העבודה. לחץ פעמיים על השער תאים בודדים המקוננים תחת דוגמת DAPI כדי להציג את אוכלוסיית התא הבודד מצינור מדגם זה. שנה את ערוץ ציר FSC לערוץ האזור DAPI ושנה את ערוץ ציר SSC להיסטוגרם.
לחץ על לחצן T ליד ציר DAPI ולחץ על התאמה אישית של ציר כדי להתאים את קנה המידה ולהגדיל את ההפרדה בין DAPI חיובי לבין פסגות שליליות DAPI. לחצו על 'החל' בחלון הנפתח ובחרו בלחצן 'שער טווח'. פרוש אותו על-פני השיא השלילי של DAPI ותייג שער זה בתאים חיים.
העתק את השער תאים חיים והדבק אותו מתחת לשער תאים בודדים, תחת צינורות APC ISO DEAB ו- ALDH CD133, כדי לבחור את אותו חלק של תאים חיים בכל צינור. לאחר מכן לחצו פעמיים על האוכלוסיה 'תאים חיים' המקוננת תחת קובץ הדוגמה של APC ISO, והחליפו את ציר ה- X לאזור ALDH ואת ציר ה- Y לאזור APC. החל שער רביע ולהתאים את ההצטלבות של השער כגון כי כ 0.5% מהאוכלוסייה שוכנת בפינה השמאלית העליונה של חלון העלילה.
לאחר מכן תן שם לרביעים כרצונך ולאחר מכן העתק והדבק את שערי הרבעים על אוכלוסיית התאים החיים המקוננים תחת קובץ DEAB והתאם את הקו האנכי כך שכ- 0.15% מאוכלוסיית התאים נמצאת בתוך הרביע החיובי של ALDH. לבסוף, להעתיק ולהדביק את שערי הרבע לקבצי ALDH CD133 אוכלוסיית תאים חיים והערכה פרופורציות תא גזע סרטן מבוסס על פרופורציות ALDH ו CD133. פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח תפוקה גבוהה של תאי גזע סרטניים שמקורם בחולה.
מעט כמו 10 תאים ל באר יכול ליצור כדוריות אמינות כמו התאים להתרבות, כדוריות להתרחב בגודל. ניתן לכמת בקלות את יכולת ההתפשטות באמצעות מוצ"ש פרחים מבוסס ססזורין. ההשפעה של תרופות על מורפולוגיה ספרואידית ניתן לדמיין עם הדמיה ניגודיות פאזה לכמת על ידי השוואת פלורנטיות resazurin בתאים מטופלים ומטופלים.
מוות תאי יכול להיות מאומת באמצעות תוספת של Calcein-AM ואתידיום homodimer אני לספרואידים, ואחריו הדמיה על מיקרוסקופ קונפוקל. לבסוף, ניתן לקצור ולפזר כדוריות לתוך השעיה של תאים בודדים לניתוח עם ציטומטריית זרימה, מה המאפשר להבחין ביעילות של טיפולים תרופתיים שונים על אוכלוסיות תאים ספציפיות. כדי למנוע אובדן טיפה, אידוי בינוני וריאציה בגודל ספרואיד, חשוב לטפל הצלחות שלך בזהירות, פיפטה בדיוק לאטום לחלוטין את לוחות טיפה תלויים שלך.
כדי להעריך שינויים בביטוי גנים ואיתות מסיס עקב טיפול תרופתי, רצף RNA של תא יחיד ומסיונות אימונוסורבנטים הקשורים לאנזימים, ניתן להשתמש בהם כדי להקל על התפתחות הטיפולים. טכניקה זו מאפשרת מחקרים אונקולוגיה, רפואה מדויקת ופיתוח תרופות לחקור הטרוגניות פנים ואינטר החולה, כמו גם עמידות כימותרפיה באמצעות הקרנת תרופות תפוקה גבוהה של ביופסיות קטנות. בעת ביצוע פרוטוקול זה, הקפד ללבוש את כל ציוד המגן האישי הסטנדרטי.
כולל כפפות, משקפי בטיחות, חלוקי מעבדה, מכנסיים ונעליים צמודות.
