פרוטוקול זה מתאר את ההכנה והניתוח של biosensor ייחודי שתוכנן לזהות את הרכיבים הכימיים של שאריות ירייה. השימוש בביוסנסורים ליישומים משפטיים הוא ייחודי. הוא מייצג בעלות נמוכה, פשוט לשימוש חלופה מכשור מיוחד מאוד המשמש בדרך כלל במעבדות משפטיות.
ניתן להשתמש בשיטות הביולוגיה הסינתטיות המתוארות עבור כל מערכת המשתמשת בחלקי ביולוגיה סינתטיים סטנדרטיים. הניתוח הכימי המתואר חל על כל ביזנסור המבטא חלבון פלואורסצנטי אדום. הדגמת ההליך תהיה אנדריאה סולס ואל ריצ'רדסון, סטודנטים לתואר ראשון באוניברסיטת לונגווד.
כדי להתחיל בהליך זה, להוסיף עשרה microliters של ה-DNA פלסמיד J10060 מבודד בעבר לצינור microcentrifuge. הוסף שמונה מיקרוליטרים של מים, ומיקרוליטר אחד של כל אחד מהאנזימים EcoRI ו- NHEL מעורבב מראש עם מיקרוליטר אחד של חיץ. לדנ"א של האמרגן, הוסיפו עשרה מיקרוליטרים של רצפי דנ"א של מקדמים חישולים לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי.
הוסף שמונה מיקרוליטרים של מים, ומיקרוליטר אחד של כל אחד מהאנזימים EcoRI ו- NHEL מעורבב מראש עם מיקרוליטר אחד של חיץ. באמצעות פיפטה להגדיר עשרה microliters, בעדינות pipette את הדגימות למעלה ולמטה לערבב. דגירה הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
לאחר מכן, מחממים ופעילים את האנזימים ב 80 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחסן את ה-DNA מתעכל במקפיא עד מוכן להמשיך. ראשית, השתמש בדנ"א הפלסמיד והמקדם שעוכל בעבר כדי להגדיר את התגובה בצינור מיקרו-סטריפוגה על קרח, כמתואר בטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט.
הקפד להוסיף את T4 DNA Ligase האחרון. פיפטה מעלה ומטה בעדינות כדי לערבב את התגובה, וצנטריפוגה בקצרה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות.
לאחר מכן, מחממים ומפעילים ב 65 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות. בצע את ההמרה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. תחילה, הגדר את תערובות התגובה עבור PCR כמפורט בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט.
בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את התגובות. באמצעות קצה פיפטה צהוב, לגרד מושבה של E.coli טרנספורמציה. העבר החלקה של E.coli זה על לוחית אגר LB-אמפילין חדשה שנוקטעה, ולאחר מכן הכנס את קצה פיפטה לתוך צינור PCR.
לנער את קצה פיפטה לערבב את E.Coli עם תערובת PCR. חזור על תהליך זה שלוש פעמים נוספות עבור מושבות נוספות. לאחר מכן, לטעון את צינורות PCR לתוך מכונת PCR, ולהתחיל תרמוסיקלינג כפי שמתואר בטבלה שלוש של פרוטוקול הטקסט.
כדי להתחיל לתייג את המספר המתאים של צינורות תרבות סטרילית כמפורט בטבלה הרביעית של פרוטוקול הטקסט. מוסיפים שני מיליליטר של מרק התרבות המוכן לכל צינור. הוסף את פתרון מלאי אנילייט לצינורות כמתואר בטבלה ארבע.
לאחר מכן, מניחים את כובעי הצמד על צינורות התרבות, כך שהם רופפים כדי לאפשר זרימת אוויר לתוך הצינור. וורטקס כל צינור תרבות. לאחר מכן, מניחים את הצינורות לתוך אינקובטור רועד ב 37 מעלות צלזיוס וב 220 סל"ד לפחות 24 שעות.
ראשית, השתמש במגבון מבוסס אתנול המיועד להסרת עופרת כדי לנגב את כל משטחי הידיים, כולל בין האצבעות. לאחסן את המגבונים בשקית איטום שכותרתו כראוי עד לניתוח. השתמשו במגבון מבוסס אלכוהול כדי לנגב משטחים גדולים לבדיקה.
השתמש בהחלפת כותנה לחה עם אתנול כדי לנגב את כל המשטחים הקטנים כדי להיבדק. לובש כפפות נקיות באמצעות מספריים כי כבר ניקה עם אלכוהול, לחתוך קטע כי הוא כ סנטימטר מרובע אחד ממרכז הניגוב. לאחר מכן, מניחים את חתיכת לחתוך של לנגב, או צמר גפן ספוגית, ישירות לתוך צינור תרבות המכיל שני מיליליטר של חיידקי החיישן, ולהבטיח כי הוא שקוע לחלוטין במרק.
הכינו את הספקטרומטר לאיסוף הגשה פלואורסצנטית באורך הגל המתאים לגרסת RFP, עם אורך גל של 500 ננומטר. לאחר מכן, השתמש מערבל מערבולת לנער את הצינורות. מעבירים בזהירות כל על-טבעי לפחית בנפח נמוך, ואוסף את עוצמת הפליטה.
באמצעות מערבל מערבולת, לנער את הצינורות. מעבירים 200 מיקרוליטרים של המרק לגם בצלחת הטובה. הקלט אילו דגימות נכנסו לכל באר של צלחת זו.
הגדר את מד הקמח כדי לאסוף את עוצמת הפליטה באורך הגל המתאים עבור גרסה RFP. ספקטרום הפלואורסצנטיות עבור גרסה RFP מייצגת מראה הן את השליטה השלילית והן את הספקטרום בשתי רמות שונות של אנילייט שנוספו. האות הפלואורסצנטי המרבי עבור וריאנט RFP המשמש בעבודה זו נצפה ב 575 ננומטר.
נתונים מייצגים נאספים עבור אותה קבוצת פתרונות, הן מהספקטרומטר הנייד והן מהנוהורמטר. יש מגמה כללית של הפלואורסצנטיות עולה כמו הריכוז של אנילייט עולה. ראוי לציין כי בריכוזים גבוהים, מעל 800 חלקים למיליארד עבור חיישן העופרת, התגובה יורדת בשל הרעילות של עופרת בריכוז כה גבוה.
ניתוח של דגימות ספוגית אתנול מבפנים של מעטפת מחסנית 40 קליבר בילה מספק הוכחת תוצאות עקרוניות. התוצאות החיוביות מכל אחד משלושת חיידקי החיישן מצביעות על בדיקה חיובית לשאריות ירייה. ניתן להשתמש בביוסנסורים שהוכנו בפרוטוקול זה גם בנפרד כדי לזהות זיהום בדגימות מזון, מים או סביבה.
טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לפתח biosensors באמצעות טכניקות ביולוגיה סינתטית סטנדרטית עבור מגוון רחב של אניליטים כימיים שונים. ציוד מגן אישי צריך להיות משוחק, אנליסטים צריכים לשטוף ידיים ולחטא משטחים לאחר טיפול E.coli. פסולת צריכה להיות autoclaved, וכל פסולת המכילה מתכת כבדה יש לטפל בהתאם.
