באמצעות רק מודל לפתח מודל מסת סרטן hepatocellular יכול לעזור לאנשים להאיר את האימונוטוסובלנות הנגרמת על ידי הגידול שלהם טיפול ספציפי המושרה, כל immunoresponses הגידול. הגידול אורתוטופי המתפתח עם טכניקת פיברוזיס בכבד מחקה את התכונות הקליניות של סרטן הכבד האנושי. שיטה זו יכולה לספק כלי שימושי במחקר אימונולוגי סרטן hepatocellular.
הדגמה חזותית של שיטה זו יכולה להמחיש את השלבים המאתגרים יותר מבחינה טכנית, כגון הזרקת ההזרקה ההיאטרספלנית, החיוניים לביצוע מוצלח של פרוטוקול זה. לאחר מכן, לרסן באופן ידני זכר, שישה עד שמונה שבועות C57 שחור 6 עכבר הגב בצד למעלה. השתמשו במדים חלופיים של 70%אתנול ובתדין כדי לנקות את אתר ההזרקה שלוש פעמים.
לאחר מכן לספק 160 microliters של tetrachloride פחמן לעכבר על ידי הזרקה תוך-לידתית ולהחזיר את החיה לכלוב הבית שלה. לאחר אישור חוסר תגובה לצביטת בוהן, בעכבר מהופנט 40 T אנטיגן בן חמישה חודשים, למקם את העכבר במצב supine ולאבטח את הגפיים עם סרט הדבקה. בצע חתך לפרוטומיה קו האמצע לאורך לינאה אלבה, גדול מספיק כדי לספק חשיפה נאותה של הכבד, ולעקור את המעיים שמאלה.
לנתח מעל הכבד לחשיפה את הנבוב הנבוב הנחות. לגרום מלחצי עורקים כדי לצרף את הכלי. השתמש במחט פרפר כדי לקבל גישה תוך וריד לווריד הפורטל ולאבטח ידנית את הקטטר.
בזהירות החלפת מזרקים עבור כל פתרון, בהצלחה לספק 15 מיליליטר של פתרון אחד, 15 מיליליטר של 0.75% פתרון קולגנס שתיים, ו 15 מיליליטר של פתרון שני ללא קולגן באמצעות קטטר, ב 8.9 מיליליטר משוער של פתרון לדקה קצב זרימה. בסוף חליטה, לקצור את מסת הגידול לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר המכיל 10 עד 15 מיליליטר של PBS. Excise הגידול מהעכבר הבא MTD2 כפי שהוכח רק.
השתמש במספריים כדי לחתוך את הכבדים לחתיכות קטנות יותר. להעביר את הרקמות לתוך מיכל חדש של PBS טרי כדי להסיר את שאר הדם מן הרקמה לפני העברת חתיכות הרקמה לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של מדיום RPMI מלא. טחון את דגימות הכבד שטף עד חתיכות יכול להתאים בקלות דרך קצה של פיפיטר חמישה מיליליטר.
מוסיפים מספיק מדיום לצינור כדי להגיע לנפח סופי של 30 מיליליטר. השתמש פיפט חמישה מיליליטר כדי triturate שברי הרקמה, לפני סינון הפתרון באמצעות מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש 50 מיליליטר. לשטוף את מסננת מספר פעמים עם מדיום מלא.
כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 50 מיליליטר עם מדיום שלם נוסף. במהירות לסובב את ההשעיה על ידי צנטריפוגה למקסימום של 50 פעמים g לפני עצירת הצנטריפוגה ו decanting את supernatant. ואז תן שימוש חוזר את גלולה ב20 מיליליטר של PBS לספירה.
להזרקה תוך-תפל של ההפטוציטים MTD2, טען מזרק של מיליליטר אחד המצויד במחט של 27 מד לכל בעל חיים נמען עם 220 מיקרוליטרים של hepatocytes לכל עכבר. אשר חוסר תגובה לצביטת בוהן בבעל חיים הרדמה, פחמן tetrachloride מטופלים. החל ממש מתחת לשריר עמוד השדרה, הבא, לעשות חתך של סנטימטר אחד על האגף השמאלי במקביל הצלע השלוש עשרה מן הקיצוני הגבי ולהשתמש מטלפים מחודדים קהה כדי להחריח את הטחול.
חתוך את הטחול בשני קליפי טיטניום בגודל בינוני בין העורק הטחול לווריד, וספק 200 מיקרוליטרים של תאים לקוטב הנחות של הטחול. חותכים את הענף הנחות של הפדיקל עם קליפ אחד בגודל בינוני וחותכים את הטחול בין שני הקליפים שהוצבו בתחילה. הסר את הקוטב הנחות של הטחול שהוזרק ישירות עם תאים סרטניים ולהשתמש 3-0 פוליגלקטין 910 תפור מופרע כדי לסגור את שכבת השריר הפנימי.
לאחר מכן השתמשו בפצעי פלדה מעוקרים כדי לסגור את שכבת העור החיצונית ולנהל תת עורית חמישה מיליגרם לקילוגרם של קרפרופן. לאחר בידוד מעכברים מהו מהודרים אנטיגן T כפי שהוכח, הן hepatocytes ותאים חודרים לגידול ניתן לראות. התאים בדרך כלל מדגימים כמעט 100%הכדאיות לאחר העיבוד.
לאחר חיסון תוך-תפל לבעלי חיים שטופלו בפחמן מסוג פראי, ההפטוציטים המושתלים מגדלים בהצלחה ובאמינות גידולי קרצינומה אורתוטופיים המפטיקולריים המבטאים את נגיף הסימאיאן הספציפי לגידול 40 T אנטיגן. הכנת האוכלוסייה בת קיימא וטהור שלנו של hepatocytes מן המסה MTD2 ניהול מדויק של הזרקת intrasplenic חשובים להצלחת ההליך. למרות שהצוות שלנו בדק חיסון hepatocyte לעכברים נמען באמצעות הזרקה תוך-וסקולרית ותוך-עינית, שיטות אחרות אלה לא הצליחו לגרום קרצינומה hepatocellular אורתוטופית.
מודל זה מספק פלטפורמה ייחודית המאפשרת חקירה למעקב חיסוני וסובלנות בשלבים המוקדמים והמאוחרים יותר של התקדמות הגידול. אנא היזהר בעת שימוש tetrachloride פחמן, כפי שהוא רעיל.
