וידאו זה מראה כיצד להכין שני סוגים שונים של מצעים תרבות התא באמצעות קולגן מסוג I ושיטת תרבות דו מימדית ותלת מימדית. שיטת התרבות התלת מימדית נחשבת לסביבה הביולוגית, ומדגימה כיצד להכין בקלות מצע תרבות תלת מימדי שימושי למחקרים. בסוגי תאים רבים, למרות השימוש באותו קולגן, התנהגות התא משתנה במידה ניכרת בין מצעים דו מימדיים ותלת מימדיים.
באמצעות מצע תרבות תלת מימדי, ניתן לבחון בקלות התנהגות תאים הדומה יותר לאלה של אורגניזמים חיים. שיטה זו היא פשוטה מאוד ודורשת ריג'נט מיוחד מינימלי. הדגמה חזותית היא קריטית, כי בעוד שאנחנו רוצים להוכיח כי שיטה זו היא ניסתה בקלות, ג'ל תלת מימדי הוא שביר, וטיפול בו כראוי חשוב מאוד.
כדי להתחיל, להכין את מדיום התרבות המתאים. כדי להתחיל להכין את הקולגן, מניחים 10x PBS, מים deionized, קולגן, צלחת תרבות 96 באר, צינור ריק שני מיליליטר על קרח. באמצעות פיפטה, להוסיף 1.12 מיליליטר של מים deionized לצינור ריק שני מיליליטר.
הוסיפו 200 מיקרוליטרים של 10x PBS למים המיומנים, ונערו בעדינות את הצינור מספר פעמים. מיד לפני השימוש, להוסיף 0.66 מיליליטר של קולגן לצינור שני מיליליטר. בעדינות ובמהירות לנער את הצינור מספר פעמים.
יוצקים 100 מיקרוליטרים של פתרון קולגן זה לתוך כל באר של צלחת תרבות 96 היטב, הקפד לכסות את כל פני השטח של בארות. לנער בעדינות את הצלחת בתנועה משמאל לימין. הדגירה את צלחת התרבות באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
ואז להטות את הצלחת כדי לאשר את gelation של הקולגן, ולהזיז את צלחת התרבות לספסל נקי. יוצקים בעדינות 150 מיקרוליטרים של K110 על הג'לים על ידי צינורות לאורך קיר הבירה. אינקובט באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
לאחר מכן, להעביר את צלחת התרבות לספסל נקי. מיד לפני תרבות התא, השתמש פיפטה כדי להשליך בעדינות את K110. ראשית להשתמש פיפטה להוסיף ארבעה microliters של קולגן ל 1.2 מיליליטר של חומצה הידרוכלורית מילימולרית אחת בצינור 1.5 מיליליטר, ומערבבים בעדינות.
יוצקים 100 מיקרוליטרים של תערובת קולגן זו לתוך כל באר של צלחת תרבות חדשה של 96 באר. מנערים בעדינות את הצלחת בתנועה משמאל לימין ומטגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, להשליך את פתרון הקולגן.
באמצעות פיפטה, לשטוף כל גם עם PBS. הוסיפו 150 מיקרוליטרים של 1%BSA ו-PBS לכל באר של צלחת התרבות, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה. לפני תרבות התאים, בטל את הפתרון של 1%BSA.
כדי להתחיל, להכין את התאים FEPE1L-8 ואת K110, טריפסין, מעכב טריפסין כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. בזהירות להסיר את המדיום מן צלחת התרבות, ולהשתמש פיפטה להוסיף שלושה מיליליטר של 0.05% טריפסין. מניחים את המנה בחזרה לתוך אינקובטור פחמן דו חמצני, ואת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
לאחר מכן השתמש במיקרוסקופיה ניגודית פאזה בהגדלה של פי 10 כדי לבדוק אם יש ניתוק תאים מפני השטח של צלחת התרבות. מוסיפים שלושה מיליליטר של מעכבי טריפסין, ולהשתמש פיפטה כדי לאסוף את התאים מנותקים בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות.
לאחר מכן, להשליך את supernatant, ולתלות את גלולה ב 10 מיליליטר של K110. השתמש במיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 10 כדי לספור את התאים, ודלל את התאים עם K110 לצפיפות תאים של 50,000 תאים למיליליטר. בעדינות זרע 0.1 מיליליטר של ההשעיה התא לתוך כל באר של צלחת התרבות על ידי צינורות לאורך הקיר של הבאר.
אינקובט באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס למשך הזמן המתאים. ראשית לערבב 130 microliters של מלח טטרזוליום WST-8 עם 1.3 מיליליטר של K110 שחומם מראש בצינור שני מיליליטר. מעבירים את צלחת התרבות לספסל נקי, ולהשתמש פיפטה כדי להשליך בעדינות את K110 מן הבארים.
יש לשטוף בעדינות תאים לא עקביים עם K110. לאחר מכן הוסיפו 110 מיקרוליטרים של K110 מעורבבים עם WST-8 לכל באר. אינקובט באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
לאחר מכן, להעביר את צלחת התרבות לספסל נקי. לאסוף 100 microliters של המדיום מותנה מכל באר, ולהעביר אותו לתוך הבארים של צלחת תרבות חדשה 96 באר. באמצעות קורא מיקרופלסטיק, למדוד את הספיגה ב 450 ננומטר, ולה מעריך את מספר תאים קיימא.
מורפולוגיה התא נצפתה על צורות לא סיביים פיבריל מוצגים כאן. ב שעתיים הראשונות של culturing, התאים לדבוק ולהפיץ על שתי צורות של קולגן. שלושה ימים לאחר הזריעה, תאים בצורה שאינה סיבית ממשיכים להתפשט, ומספרי התאים גדלים, בעוד התאים בטופס הפיבריל מראים התפשטות מוגבלת.
תאי FEPE1L-8 ממשיכים להתרבות על הצורה הלא סיבית של קולגן מסוג I ועל משטחי המנה הלא מטופלים. לעומת זאת, התאים אינם מתרבים על צורת הפיבריל. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור כי ג'ל תלת מימדי הוא שביר מאוד.
יש להיזהר כדי להבטיח כי הפתרון או טיפים לא באים במגע ישיר עם ג'לים. ניתן לשנות שיטה זו בדרכים רבות. לדוגמה, כדי לערבב את רכיבי הממברנה של הדגימה, ניתן ליצור מצע לתרבות תאים המחקה קרום מרתף.
במקרים רבים, הפונקציות של מטריצה חוץ-תאית בגופים חיים אינן ידועות. לתאי תרבות בתרבות התלת מימדית, ניתן לבחון את הפונקציה של רכיב מטריצה חוץ-תאית הדומה יותר לגוף החי. על ידי יישום טכניקות תלת מימדיות של תרבות ג'ל, ניתן לבדוק ביעילות את ריכוז התרופות בתאים.
פרוטוקול זה, המבוסס על מטרתו של האדם, יכול לשמש לפיתוח מצעי תרבות תלת מימדיים מורכבים על ידי ערבוב רכיבי EGM אחרים או גורמי גדילה במהלך gelations.
