המטרה הכוללת של טכניקה זו היא הערכת ההשפעה של מניפולציות ביטוי גנים על ארכיטקטורה עצבית קליפת המוח ב vivo. היתרון העיקרי הראשון שלנו בהליך זה על פני אלה המבוססים על אלקטרופורציה נייטרלית, הוא השליטה העדינה ברמות ביטוי הגנים. באופן ספציפי, צינור משולב זה מאפשר את הערכת in vivo של פגם, מווסל על ידי שינויים קטנים בביטוי גנים על השליטה של cytoarchitecture עצבי.
יתר על כן, מבנה הזוג של בדיקת ההשתלה מאפשר הפחתה עצומה במספר בעלי החיים הדרושים כדי להשיג תוצאות מובהקות סטטיסטית. הטכניקה מנצלת מאגר מבשר שמקורו בעוברים מהופנטים טאו EGFP. בריכה זו מחולקת לשתי בריכות משנה כי הם נגועים לחילופין עם שתי lentiviral מערבב.
כדי להשיג בריכת בדיקה ירוקה ובריכת בקרה צהובה כי יהיה במשותף מוזרק. לאחר יומיים של התרחבות במבחנה, הספירות הנוירו וכתוצאה מכך מנותקות, מעורבבות אחת לאחד, ומוזרקות עם נימי בחלל חדר העכבר. עשרה ימים לאחר מכן, חיסון על חלקים coronal מבוצעת כדי לאפשר את ההשוואה בין נוירונים בדיקה ושליטה.
לבסוף, החלקים הכשלים בחיסון הם בתמונה ושלד להערכה סופית של פרמטרים מורפומטריים. לפני השתלת vivo, להכין את הבריכה הירוקה מבשר. E12.5 עוברים, שנקטפו מסכר בהריון שהומתק בעבר למייסד טאו EGFP, מוגדרים בארות בודדות של צלחת רב בארות בתת פתרון PBS.
גנוטיפ אותם במהירות על ידי בדיקה חזותית תחת מנורת אור כחול. נתק את הקורטיות הירוקות המנותנות לתאים בודדים. השהה מחדש תאים במדיום שגשוג, והכנס אותם לשתי תתי-מאגרים בגודל שווה.
להדביק כל תת בריכה עם תערובת lentiviral ייעודית. כל תערובת מכילה וירוס תווית אדומה או וירוס בקרה שחורה. כמו גם וירוסים עבור ביטוי טרנסג'ן מונחה Tet-Off או בקרה, בהתאמה.
כל lentivirus חייב להינתן בריבוי של זיהום של 8. צלחת התאים הנגועים במדיום התפשטות עם 2 מיקרוגרם למיליליטר של דוקסיציקלין. מעבירים תאים לאנקובטור ומשאירים אותם ליומיים ב-37 מעלות.
לאחר יומיים, שתי תת הבריכות חייבות להופיע כהשעיות של נוירוספרות קטנות. מבטא הומוגנית את החלבון הפלואורסצנטי האדום, או לא. לאחר ההנדסה של מבשרים, להגדיר מערך להעריך להשתלה P0 גורי מעבדה לבנים.
השתמש נימי זכוכית borosilicate עם קוטר נצחי ופנימי שווה 1.5 מילימטרים ו 1.12 מילימטרים, בהתאמה. משוך את נימי עם מושך P1000. ראשית, הזן את תוכנית משיכה.
שנית, מניחים את נימי למחזיקים ומהדקים אותם. שלישית, התחל את התוכנית וקח את שני המיקרו-capillaries שנמשכו. חותכים את קצה נימי, ביד עם אזמל, מתחת סטריאומיקרוסקופ כדי לקבל קצה עם קוטר חיצוני של 200-250 מיקרומטר.
לבסוף, מניחים את הניבים על התמיכה הפלסטלינה בצלחת פטרי סגורה, ומעבירים אותה מתחת למכסה המנוע. לחטא סיבים אופטיים ולה מניחים אותם מתחת למכסה המנוע. מערבבים את התערובות הראשיות של EGTA ו-Fast Green, כדי להכין את פתרון מעקב התאים, ומ מניחים אותו שוב מתחת למכסה המנוע.
חותכים חתיכות קטנות של סרט איטום מעבדה עבור איתור השעיית תא. ולבסוף, להכין פתרון של 1 מיליגרם למיליליטר דוקסיציקלין סטרילי השליך במזרק 0.3 מיליליטר. צינור ההזרקה מוכן משני צינורות לטקס.
תקן חתיכת פה מפלסטיק קשיח לקצה אחד של צינור לטקס. לאחר מכן, לתקן את מחזיק נימי לקצה אחד של צינור לטקס השני. חבר את הקצוות החופשיים של שני צינורות לטקס ממסנן סטרילי 0.45 מיקרומטר, כמחסום נגד חיידקי המפעיל.
מניחים את הרכבה צינור שאפתן וכתוצאה מכך על מחזיק פלסטיק להישמר מתחת למכסה המנוע. לאסוף, לבדוק ולשלוט נוירוספרות בצינורות נפרדים. השעיות נוירוספרה צנטריפוגה ולהחליף את על טבעי על ידי PBS.
חזור על רצף זה פעמיים נוספות. השעיות נוירוספרה צנטריפוגה, להחליף את supernatant על ידי פתרון טריפסין, ו pipette גלולת התא למעלה ולמטה, 4, 5 פעמים. השאירו תאים באינקובטור למשך חמש דקות כדי לקבל השעיה של תא אחד.
לחסום טריפסין עם פתרון מעכבי טריפסין. תאי צנטריפוגה, ולהשעות אותם מחדש במדיום שגשוג טרי. לספור תאים של שתי הבריכות ולהתאים את הריכוז שלהם ל 100, 000 תאים לכל microliter, במדיום שגשוג.
לאחר מכן, מערבבים את תאי הבדיקה והבקרה 1:1 ובדקו את התערובת המתקבלת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לבסוף, מניחים את התערובת על קרח מתחת למכסה המנוע. הכינו את הכלוב עם האם והגורים על שולחן הרחק מאזור המפעיל הכירורגי.
שים כלוב התאוששות על עגלה. שים תערובת של נסורת שנלקחה מהכלוב של האם בתחתיתו, והניח את כלוב ההתאוששות מתחת למנורה. בצד, מניחים קופסת קרח מכוסה בנייר אלומיניום עבור ההרדמה של גורי P0.
ממש לפני ההשתלה, להוסיף 1 עד 10 נפח של פתרון מעקב תאים לנפח אחד של השעיית תא, ולאתר שלושה microliters של תערובת וכתוצאה מכך על פיסת סרט איטום מעבדה. מניחים את הגור על רדיד אלומיניום קריר במשך דקה אחת, ולבדוק שהוא הרדמה מלאה. בינתיים, שאפו את 3 המיקרוליטרים של תערובת ההזרקה לתוך נימי הזכוכית.
מנגבים בעדינות את ראש הגור הרדמה עם 70% אתנול. לאחר מכן, לאתר אותו על הסיב האופטי, כדי לזהות בבירור את ההמיספרות קליפת המוח. הזן את נימי לחזית וגישה לחלל החדר.
בזמן שאתה עושה את זה, לשים לב לא לפגוע בכלי הדם. כדי למנוע נזק של הוד גנגליוני, לסובב את המחט באופן משני על ידי שלושים מעלות. בעדינות להזריק את התאים לתוך החלל ולפקח על ההיתוך שלהם באמצעות ירוק מהיר.
חכה חמש עד עשר שניות. הסר את מחט הזכוכית, דואג לא לשאיף את ההשעיה התא, ולהשליך אותו בפח סילוק מתאים. לפני התאוששות גור מהרדמה, להזריק 150 microliters של פתרון דוקסי intraperitoneally, כדי לשמור על ביטוי מהונדס עדיין כבוי לאחר ההשתלה.
לאחר ההזרקה, מניחים את הגורים מיד מתחת למנורה להחלמה. השאירו את הגורים שם במשך חמש עד עשר דקות, וברגע שהם ערים לחלוטין, מניחים אותם בכלוב עם האם. שימו לב לגורים המופעלים במשך שעתיים עד שלוש שעות, כדי להבטיח שהאם תקבל אותם.
לספק את הכלוב עם מי שתייה המכילים 0.5mg/ mL דוקסיציקלין סוכרוז, כדי לשמור על הביטוי מהומר כבוי. החלף את הדוקסיציקלין המכיל מים במים נטולי דוקסי ארבעה ימים לאחר ההשתלה. ובכך מפעיל את הגן הטרנס-גנטי בנוירונים פוסט-מיוטיים.
שמור עכברים במשטר ללא דוקסי במשך שישה ימים, ולהרים אותם ב P10. תקן מוחות מגורים המתת ים ב 4% PFA, בארבע מעלות, לילה. הסר את פתרון ה- PFA והחלף אותו בפתרון 30%sucrose.
השאירו את המוח בארבע מעלות עד שהם שוקעים לתחתית הבקבוקון. מעבירים את המוח לתבנית הטבעה חד פעמית כחצי מלאה במדיום הכללת קריו. להקפיא את המוח הכלול ב 80 מעלות.
חותכים 60 מיקרון עבה חלקים coronal באמצעות קריוסטט. תעבד מקטעים עבור אנטי-GFP, נגד שפעת חיסונית של RFP ונגד פתרון DAPI. הגדר פרמטרי עבודה של המיקרוסקופ הקונפוקלי כראוי כפי שמוצג.
לאסוף תמונות של פרוסות immunoassayed, בחירת GFP חיובי נוירון עשיר שדות צילום עיוור של הפצת אותות RFP. יצא את התמונות כקבצי ND2 וליצור מקסימום z-הקרנות שלהם כקבצי TIFF. כדי לאפשר שלד נוירון עוקב עיוור של גנוטיפ התא, להסתיר את האות האדום.
לשם כך, הוסיפו שכבת התאמה. בחר רמות, בחר אדום. הגדר פלט לאפס.
ולשמור את הקובץ ככזה. שלד מבוצע לאחר מכן על ידי מפעיל חדש, שלא הייתה לו גישה קודמת לקבצים אדומים רגילים מקוריים. לכל קובץ אדום מוסתר, פתחו את הקובץ, הוסיפו שכבת ציור לתמונה הראשית ובחרו בכלי העיפרון.
עקוב אחר somer על בסיס אות GFP. לאחר מכן, עקוב אחר הנוריטים. לבסוף, שמור את קובץ mutlilayer, כולל צלליות עצביות.
ניתוח עוקב של שלדים עצביים יכול להתבצע על ידי כל אחד מהמפעילים. פתחו כל קובץ mulitlayer, צרו קבצים ריקים חדשים בגווני אפור של 16 סיביות עם רקע שחור. אחד לכל נוירון.
העתק והדבק צלליות עצביות בודדות, מהתמונה הראשית, לקבצים בגווני אפור. חזור לקובץ רב שכבתי כבה את שכבת ההתאמה כדי לחשוף גנוטיפים עצביים. שמור את הקבצים בגווני אפור של 16 סיביות, ביאורים של גנוטיפים מתאימים של נוירונים.
יבא תמונות בגווני אפור ב- ImageJ בזה אחר זה, ונתח שלדים לפי תוסף NeurphologyJ. לאסוף נתונים ראשוניים נבחרים NeurophologyJ, שטח כולל של אורך neurite, נקודות קובץ מצורף ונקודות קצה, לתוך גיליון אלקטרוני, ומעסיקים אותם כדי לחשב פרמטרים מורפומטריים משניים. הפרוטוקול ההנדסי שאנו מציעים מאפשר להפוך את הרוב המכריע של הנוירונים לנושא החקירה, עם ערכות הטרנסג'נדרים המיועדות.
יתר על כן, הוא מאפשר להשיג הומוגניות משמעותית של רמות ביטוי מהומר בתוך אוכלוסיית התאים מתמרן. תכונה מרכזית של ההליך שלנו, היא תצורה מזווגת. בדיקה ובריכת מבשר בקרה מהונדסים בנפרד, מעורבים 1:1, ולבסוף מושתלים במשותף.
גישה מזווגת זו תאפשר זיהוי של הבדלי תוצאות הקשורים במיוחד לגנוטיפים נפרדים. בדוגמה זו, ניתחנו חלקים קורונטל של גורים מושתלים, עשרה ימים לאחר הזרקת שיתוף בין-תאית של Foxg1 ביטוי יתר של נוירונים מבשרי ושליטה אלה. תמונות של קבוצות של נוירונים נרכשו עם מיקרוסקופיה קונפוקל.
קבצי מחסנית Z שימשו לזיכרון התחזיות המרביות. צלליות עצביות אותרו ידנית. כאן, צלליות ירוקות וצהובות מייצגות את הנוירונים של Foxg1 שמבטאים ושולטים יתר על כן, בהתאמה.
לבסוף, פרמטרים ראשוניים שהתקבלו על ידי ניתוח NeurphologyJ, הועסקו לחישוב מדדים מורפומטריים משניים, כפי שמודגם. זהו פרוטוקול פשוט המאפשר לחוקר להעריך את ההשפעה כי הביטוי המעורב של גן נתון, עשוי להפעיל על שליטה עדנה של התפתחות neurite darth in vivo. היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם שניים.
מספר קיים של גנים המעורבים morphogenesis עצבי עשוי להיות מאופיין תפקודית ב vivo, בהיעדר הקווים הטרטוגניים המתאימים. ופחות בעלי חיים נדרשים לניתוח כדי לקבל את התוצאות הסטטיסטיות המשמעותיות.
