פרוטוקול זה משתמש ב- CRISPR-Cas9 כדי ליצור קווי נוקאאוט או נוקאאוט. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה פשוט ויעיל לעקוב במיוחד עבור חוקרים טירון. עבור מעבר תאים, לטפל בתאים מתורבתים לילה עם שני מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA לכל צלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.
כאשר התאים התרוממים מתחתית הלוח, לנטרל את התגובה האנזימטית עם שני מיליליטר של מדיום תרבות התא, ולהעביר את ההשעיה התא צינור חרוט. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש את גלולה בחמישה מיליליטר של מדיום תרבות תאים טריים לספירה. ואז לזרוע 1.8 פעמים 10 לתאים החמישיים לתוך באר אחת של צלחת תרבות רקמה 24 באר לתרבות הלילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
עבור transfection של התאים, להוסיף נפח מתאים של תערובת transfection המכיל את הריכוז המתאים של CRISPR פלסמיד לנפח המתאים של reagent transfection, על פי העיצוב הניסיוני ואת הוראות היצרן. לאחר דגירה תערובת transfection בטמפרטורת החדר לתקופה המומלצת של זמן, להוסיף את הפתרון לתאים בצורה טיפה חכם. לאחר מכן מערבבים בעדינות את הצלחת כדי לערבב ולה מניחים את הצלחת באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
בסוף ההמרה, להוסיף 150 microliters של טריפסין-EDTA לנתק את התאים כפי שהוכח רק ולאסוף את התאים מנותקים על ידי צנטריפוגה. תן שימוש חוזר את גלולה בסרום בקר עוברי 2% ב- PBS ולסנן את התאים דרך מסננת רשת 30 מיקרומטר לתוך מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות חמישה מיליליטר, או צינור FACS. לאחר מכן השתמש בתאים שאינם מנופים כדי להגדיר שער בקרה שלילי על ציטומטר הזרימה ולמיין את התאים המותכים על פי סמן הפלואורסצנט בפלסמיד CRISPR המשמש להתהוות לצינור המכיל 100 מיקרוליטרים של מדיום תרבות התא.
כאשר כל התאים שהונפו נאספו, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה במהירות המרבית ו resuspend את גלולה ב 300 microliters של מדיום תרבות התא. זרעים 200 microliters של תאים לתוך באר אחת של צלחת תרבות רקמות 24-well ולאפשר לתאים להתאושש במשך כמה ימים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. גלולה הנותרים 100 microliters של תאים ממוינים במהירות מקסימלית במשך חמש דקות ולחלץ את ה-DNA הגנומי מן גלולה וכתוצאה מכך על פי פרוטוקולי מיצוי DNA סטנדרטיים.
לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של מאגר תגובת שרשרת פולימראז, מיקרוליטר אחד של תערובת deoxynucleotide, 2.5 מיקרוליטרים של פריימר הפוך המוגדר על ידי המשתמש, 0.5 מיקרוליטרים של פולימראז DNA, שניים עד חמישה מיקרוליטרים של תבנית ה- DNA הגנומית שחולצו ומספיק מים מזוקקים כפולים כדי להביא את התגובה לנפח סופי של 50 מיקרוליטרים. הפעל את התערובת על רוכב אופניים תרמי ולפתור את התגובה על ג'ל 2%agarose באמצעות מאגר TAE 1X על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. השתמש באזמל נקי וחד כדי להפוך את מוצר תגובת שרשרת הפולימראז ולטהר את ה- DNA באמצעות ערכת מיצוי ג'ל על פי הוראות היצרן.
למדוד את הריכוז של המוצר באמצעות ספקטרופוטומטר ב 260 סופג ננומטר. הכינו תערובת בדיקה המכילה 200 ננוגרם של הדנ"א המבודד, שני מיקרוליטרים של חיץ התגובה T7 endonuclease I, ומספיק מים מזוקקים כפולים כדי להביא את הנפח הסופי של התערובת ל -19 מיקרוליטרים. Reanneal מוצר תגובת שרשרת פולימראז במחזור תרמי בפרמטרים שצוינו ומערבבים חמש יחידות של T7 אנדונוקלאז אני עם המוצר reannealed עבור דגירה 50 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה, פתור את הדנ"א המתעכל על ג'ל 2.5% agarose באמצעות חיץ 1X TAE, ודמיין את הג'ל על מערכת דימות ג'ל מתאימה. פתח את תמונת הג'ל ב- ImageJ וצייר תיבה מלבנית סביב הרצועה קרוב ככל האפשר לגבול שלה. לחצו על 'נתח' ו'קבע מידות', המאשרות שהאזור, הערך האפור הממוצע ואפשרויות הצפיפות המשולבת נבדקים.
לחצו על הלחצן 'אשר' ובחרו 'נתח' ו'מידה'. הערך הממוצע, או ערך צפיפות העוצמה הגולמית, מעיד על עוצמת הרצועה. כאשר התאים המרובים בתרבות מתחילים להיות confluent, לנתק אותם עם טריפסין-EDTA, כפי שהוכח, ולזרע את התאים בדלילות בצלחת 100 מילימטר רקמות תרבות כדי לאפשר מספיק מקום למושבות בודדות לגדול לפני החזרת התאים אינקובטור תרבות התא.
כאשר המושבות מתחילות להיווצר, השתמש במיקרוסקופ עם הגדלה של X ארבע כדי לבחור את המושבות הבודדות להעברה לתוך בארות בודדות של צלחת 24 באר המכילה 500 microliters של מדיום תרבות התא ל הבאר. יש לדאוג כי הטיפ שלך לא לגעת במושבות שמסביב כדי למנוע ערבוב של מושבות בתוך בארות בודדות או לבחור מאזור של צמיחה מושבה דליל. כאשר כל השיבוטים נבחרו, מניחים את הצלחת בחמה לתרבות התאים עד שהתרבויות הופכות למלוונטות.
מכיוון שפלסמידים לא מעוכלים הם סופר-סלילים, הם נוטים לרוץ מהר יותר מעמיתיהם ליניאריים. כדי לקבוע אם האוליגונוקלאוטידים שובטו בהצלחה לתוך עמוד השדרה של CRISPR פלסמיד, PCR המושבה מבוצעת ואת השיבוטים החיוביים מחוסנים לפני הפלסמידים מופצים ונשלחים עבור רצף סנגר. האות הפלואורסצנטי יכול להיות חזותי בקלות תחת מיקרוסקופ על מסירה מוצלחת של הפלסמידים, המאפשר לתאים המעודפים להיות ממוינים על ידי ציטומטריית זרימה.
T7 אנדונוקלאז אני מסמן מבוצע כדי לבדוק את יעילות המחשוף של ה-DNA הגנומי, כפי שחושב מן התעצמות של הלהקות שנצפו על ג'ל אגרוז. בנוסף, אם ניסוי מבוסס תיקון מכוון הומולוגיה נועד לשלב אתר הגבלה על לוקוס היעד, ניתן לבצע בדיקת פולימורפיזם באורך קטע הגבלה עם אנזים הגבלה מתאים. כדי לאמת עוד יותר כי גן קידוד חלבון הושבת בהצלחה, כתם מערבי יכול להתבצע כדי להבטיח כי אין חלבון ממוקד קיים.
מיון התאים לאחר ההטעה מבטל את התאים ללא פלסמידים משולבים, ובכך מגדיל את אחוז התאים המוקרנים בשלבים מאוחרים יותר כבעלי גן נוקאאוט או חיקוי. עם התפתחות טכניקה זו, אנו מסוגלים כעת לייצר קווי תאים נוקאאוט ללמוד תפקוד גנים וקווי תאים לדפוק במודל מחלות ספציפיות כדי להבין את המנגנון שלהם.
