טכניקות לפקח על נטל החיידקים נויטרופילים להגיב בו זמנית יכול לספק תובנה לתוך המנגנונים של התמדת Aureus Staph ואת היעילות של אסטרטגיות טיפול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי פרמטרים מרובים ניתן למדוד אורך במארח חי לאורך כל תקופת הזיהום. זה קריטי כדי להראות איפה למקם את הפצע על דורסום העכבר, איך excise את העור, וכיצד לחסן את הפצע עם Aureus Staph.
התחל על ידי הפשרת זן aureus Staph bioluminescence של זן עניין מ 80 מעלות צלזיוס שלילי אחסון על קרח. לפני שפוספסים את התרבות על צלחת אגר דם של 5%. עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
למחרת בבוקר, להעביר שלוש עד ארבע מושבות בודדות מצלחת aureus Staph לתוך מרק סויה טריפטי, או TSB. בתוספת 10 מיקרוגרם למיליליטר של כלוראמפניקול עבור דגירה רועדת לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לדלל 120 microliters של מדגם תרבות בשישה מיליליטר של TSB.
עם 10 מיקרוגרם למיליליטר של כלוראמפניקול, עבור דגירה של שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס, ו 200 סיבובים לדקה. כאשר הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מגיע 0.5, להעביר שלושה מיליליטר של השעיה חיידקית לתוך 10 מיליליטר קר כקרח DPBS. לאחר decanting בזהירות את supernatant, להוסיף DPBS מקורר נוסף גלולה, ומערבולת חיידקים מושעה מחדש ביסודיות.
לאחר צנטריפוגה שנייה, להשעות מחדש את גלולת חיידקי ב 1.5 מיליליטר של PBS על קרח. כדי לאמת את ריכוז החיידקים, לדלל באופן סדרתי 100 microliters של ההשעיה החיידקית על ידי גורם של 1 x 10 ל 4, ו 1 x 10 עד 5, ב PBS טרי. וצלחת 20 microliters של כל דילול על צלחות אגר בודדים.
לאחר דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס, לספור את מספר יחידות להרכיב מושבה על ידי בדיקה ברוטו כדי לחשב את הריכוז החיידקי מהיום הקודם. לפצעי עור כריתה של בעלי החיים המטופלים, אשרו חוסר תגובה לצביטת בוהן, לפני גילוח קטע של אחד על שניים אינץ' בגב העכבר. יש לנגב בעדינות כדי להסיר שערות תועות.
ולחטא את העור החשוף, עם יוד רציף של 10% povidone, ו-70% יישומי גזה ספוגים באתנול. נע החוצה ממרכז האזור הכירורגי, בתבנית ספירלית. לאחר מתן אפשרות לעור להתייבש במשך כדקה, לחץ בחוזקה על ביופסיית אגרוף סטרילית של שישה מילימטרים במרכז האזור הכירורגי המוכן.
סובב את ביופסיית הפונץ' כדי ליצור קו מתאר מעגלי על העור, החותך באופן מלא דרך רקמת העור, ולפחות חלק אחד של קווי המתאר. דואג לא לחתוך לתוך fascia הבסיסית או רקמה. לאחר מכן השתמש במספריים סטריליים, ומדפים, כדי לחתוך דרך האפידרמיס והדרמיס, בעקבות התבנית המעגלית שהוטבעה על ידי ביופסיית הפונץ '.
עבור חיסון Aureus Staph, למלא מזרק אינסולין 28 מד עם 50 microliters של inoculant חיידקי bioluminescent מוכן. ולהשתמש באצבע כדי למשוך את הדרמיס של החיה הפצועה לצד. מחזיק את המזרק כמעט במקביל לרקמה, לאט לאט להכניס את המזרק לתוך הרקמה עד ירידה פתאומית בהתנגדות מורגש.
מצביע על פירסינג של fascia. עם המחט להציב במרכז הפצע, לאט לספק את כל נפח של inoculant. ודא כי inoculant יוצר בועה במרכז הפצע, עם דליפה מינימלית או פיזור.
ולהסיר את המזרק לאט מהחיה. ואז להחזיר את החיה לכלוב שלה עם חום ומעקב עד החלמה מלאה. לאחר פציעה וזיהום, ויומיום במהלך הניסוי, מניחים את העכבר הרדמה בתמונה bioluminescent ו florescence, עם הפצע שטוח ככל האפשר.
בתוכנת הדמיה, בחר זוהר וצילום כ מצבי הדמיה. זמן החשיפה צריך להיות מוגדר מראש לדקה אחת ב binning קטן, F / Stop 1 עבור זוהר, F / Stop 8 לצילום, ופתוח עבור מסנן הפליטה. לאחר מכן לחץ על רכוש, כדי לתעד את התמונה.
להדמיית פרואורסצנטיות ב-vivo, בחרו פלואורסצנטיות וצילום, כ מצבי ההדמיה. זמן החשיפה צריך להיות מוגדר מראש לשנייה אחת ב binning קטן, F / Stop 1 עבור פלואורסצנטיות, F / Stop 8 לצילום, ו Excitation וארכי גל פליטה של 465 מעל 30 ננומטר, ו 520 מעל 20 ננומטר, בעוצמת מנורה גבוהה, בהתאמה. לאחר מכן לחץ על רכוש כדי לתעד את התמונה.
לאחר קבלת שני סטים של תמונות, להחזיר את החיה לכלוב שלה, עם ניטור, עד החלמה מלאה. לניתוח תמונה, פתחו את התמונה לכמת, בתוכנה מתאימה לניתוח תמונה, והצבו את אזור העניין המעגלי המוגדר כברירת מחדל על כל אזור הפצע כולל העור שמסביב. לחץ על למדוד אזור עניין, ולתזמן את הערכים עבור שטף ממוצע עבור הפצע, כדי לאפשר את שטף הממוצע של כל אות להיות מותווה לעומת הזמן.
כדי למדוד את ריפוי הפצע, להתאים אזור מעגלי של עניין על קצה הפצע, ולמדוד את שטח הפצע בסנטימטרים בריבוע, כדי לאפשר התוויית השינוי השבר מקו הבסיס לעומת הזמן. בניסוי מייצג זה, תגובה ראשונית מיאלואידית ביטוי EGFP מותנה 88, או עכברי נוקאאוט MyD88, הפגין רגישות גדולה יותר לחיסון Aureus Staph, מאשר EGFP לא מותנה להביע בעלי חיים. עם 80% קטלניות נצפתה במהלך שמונת הימים הראשונים של זיהום.
שני הזנים של עכברים איבדו כ -5% ממשקל גופם מיד לאחר ההדבקה. עם זאת, EGFP מותנה להביע עכברים התאושש המשקולות המקוריות שלהם על ידי היום השני. בעוד עכברי MyD88 לא.
סגירת פצעים בנוכחות זיהום Staph aureus לא היה שונה בין שני הזנים. עם זאת, עכברי נוקאאוט MyD88 פצועים באופן סטרילי, היה פגם משמעותי בריפוי פצעים, בהשוואה EGFP מותנה להביע בעלי חיים. הדמיה של בעלי חיים שלמים חשפה נטל חיידקי גבוה יותר, כפי שמץ של אות ביולומינסנט מוגבר בפצעים של חיות נוקאאוט MyD88, בהשוואה ל- EGFP מותנה המבטא בעלי חיים.
ירידה של 40% בסחר הראשוני בנויטרופילים לפצעים לא מדביקים של חיות נוקאאוט MyD88, נצפתה גם בהשוואה ל-EGFP מותנה המבטא בעלי חיים. כאשר 1 x 10 למושבה השביעית להרכיב יחידות של Aureus Staph הוצגו מיד לאחר הפציעה, סחר נויטרופילים היה מופחת באופן משמעותי בבעלי נוקאאוט לעומת EGFP מותנה להביע בעלי חיים. לפני חלוקת החיידקים, ודא שאין בועות אוויר במזרק, ושמיקום המחט ממוקם כראוי במרכז הפצע.
רקמות בעלי חיים ניתן לקצור בסוף הנקודה כדי למדוד את הביטוי של חלבונים של עניין והפצה חיידקית מהפצע. סטפ אוראוס מדבק לבני אדם. ככזה, ציוד מגן אישי צריך להיות משוחק בעת טיפול בחיידקים, ויש לנקוט זהירות, בעת טיפול מזרק המכיל את הפתוגן.
טכניקה זו סייעה לחקור את השימוש בטיפולים ביולוגיים עבור זיהומים Staph aureus המשפרים את המארחים המולדת התגובה החיסונית נגד זיהום.
