一种评价金黄色葡萄球菌感染先天免疫反应的小鼠模型

同时监测细菌负担和嗜中性粒细胞反应的技术可以提供对金黄色葡萄球菌持久性的机制和治疗策略的有效性的洞察。这种技术的主要优点是，在感染期间，可以在实时宿主中纵向测量多个参数。显示将伤口放在鼠标多苏姆的位置上、如何切除皮肤以及如何用金黄色葡萄球菌接种伤口至关重要。

首先从冰面上80摄氏度的负温度储存中解冻生物发光葡萄球菌菌株。在将培养在 5% 牛血加盘上之前。在37摄氏度的夜间孵育。

第二天早上，将三到四个单独的菌落从金黄色葡萄球菌盘子里转移到肉汤中，或TSB。辅以每毫升氯霉素10微克，在37摄氏度下过夜摇动孵育。第二天早上，在TSB的6毫升中稀释120微升的培养样品。

每毫升氯霉素10微克，在37摄氏度下孵育两小时，每分钟200次旋转。当 600 纳米的光学密度达到 0.5 时，将三毫升细菌悬浮液转移到 10 毫升冰冷的 DPBS 中。小心地抽取上清液后，在颗粒中加入额外的冷冻 DPBS，彻底涡流重新悬浮的细菌。

第二次离心后，将细菌颗粒重新悬浮在1.5毫升PBS冰上。为了验证细菌浓度，在新鲜 PBS 中，将细菌悬浮液的 100 微升连续稀释 1 x 10 到 4，1 x 10 到 5 倍。和板20微升每次稀释在个别阿加板。

在37摄氏度过夜孵育后，通过总检查计算成菌组的数量，以计算前一天的细菌浓度。对于接受动物的切除皮肤损伤，在剃掉鼠标背面的一两英寸部分之前，请确认对手趾捏没有反应。轻轻擦拭以去除任何杂散的头发。

并消毒暴露的皮肤，连续10%的波维酮碘，和70%乙醇浸泡纱布应用。从手术区中心向外移动，呈螺旋状模式。让皮肤干燥约一分钟后，在准备的手术区域中心用力按无菌六毫米冲孔活检。

扭曲冲孔活检，在皮肤上创建圆形轮廓，完全切穿皮肤组织，以及至少一个部分的轮廓。注意不要切入底层筋膜或组织。然后使用无菌剪刀和钳子，按照冲孔活检印印的圆形图案切割表皮和真皮。

对于金黄色葡萄球菌接种，用50微升的预制生物发光细菌注射剂填充28量胰岛素注射器。用手指把受伤动物的真皮拉到一边。将注射器与组织几乎平行，缓慢地将注射器插入组织，直到感觉到抵抗力突然降低。

指示筋膜穿孔。将针头放在伤口中心，慢慢将注射剂的整个体积送来。确认消毒剂在伤口中心形成气泡，泄漏或分散最小。

慢慢从动物中取出注射器。然后将动物返回到笼子的热量和监控，直到完全恢复。在受伤和感染后，每天在实验期间，将麻醉小鼠放在生物发光和荧光成像器中，伤口尽可能平坦。

在成像器软件中，选择发光和照片作为成像模式。曝光时间应预设为一分钟的小型装箱，F/Stop 1 的发光，F/停止 8 的照片，并打开发射过滤器。然后单击"获取"以录制图像。

对于体内荧光成像，请选择荧光和照片作为成像模式。曝光时间应预设为一秒的小型装箱，F/Stop 1 的荧光，F/Stop 8 的照片，以及 465 超过 30 纳米的激发和发射波长和 520 超过 20 纳米的发射波长，灯强度高。然后单击"获取"以录制图像。

获得两组图像后，将动物返回到其笼子，进行监控，直到完全恢复。对于图像分析，在适当的图像分析软件程序中打开要量化的图像，并在整个伤口区域（包括周围皮肤）上放置默认的圆形区域。单击测量感兴趣区域，并记录伤口的均通量值，以允许绘制每个信号的均通量与时间。

要测量伤口愈合，请将感兴趣的圆形区域设置在伤口边缘上，并测量伤口的面积（以厘米平方为单位）以图绘制基线与时间的分量变化。在这个代表性实验中，有条件EGFP表达骨髓分化原反应88，或 MyD88敲除小鼠，表现出比非有条件EGFP表达动物对金黄色葡萄球菌接种的易感性更大。在感染头八天观察到80%的致命性。

两株小鼠在感染后立即减掉了约5%的体重。然而，条件EGFP表示小鼠恢复其原来的重量第二天。而 MyD88 小鼠没有。

在金黄色葡萄球菌感染的情况下，伤口闭合在两个菌株之间没有不同。然而，与有条件的EGFP表达动物相比，无菌受伤的 MyD88 敲击小鼠在伤口愈合方面存在显著缺陷。整个动物成像显示更高的细菌负担，这从 MyD88 淘汰动物伤口的生物发光信号增加就证明，相比之下，有条件的EGFP表达动物。

与有条件的EGFP表达动物相比，最初向 MyD88 敲击动物未感染伤口的中性粒细胞贩运减少了 40%。当1×10到第7个金黄色葡萄球菌形成单位在受伤后立即引入时，与有条件的EGFP表达动物相比，在淘汰动物中，嗜中性粒细胞的贩运明显减弱。在分配细菌之前，请确保注射器中没有气泡，并且针头的位置正确定位在伤口中心。

动物组织可以在终点收获，以测量感兴趣的蛋白质的表达和细菌从伤口传播的细菌。金黄色葡萄球菌对人类具有传染性。因此，在处理细菌时应佩戴个人防护设备，在处理含有病原体的注射器时应谨慎行事。

这项技术有助于探索使用生物疗法治疗金黄色葡萄球菌感染，提高宿主对感染的先天免疫反应。