מערכת הכתבים של BW מאפשרת ללמוד אינטראקציות קולטן-ליגנד. זה מאוד שימושי במקרים שבהם ligand של קולטן מסוים אינו ידוע או במקרים שבהם הניסויים עם ליגנד אנדוגני הם קשים מבחינה טכנית. שיטה זו רגישה וסודית לקולטן בודד, קלה לתפעול ולשכפול.
הפגנת ההליך תהיה שירה כחלון, פוסט-דוק למעבדה שלי. יום לפני transfection, צלחת 10 צלחות עם 10 מיליליטר של 100, 000 BW5147 תאים, ולהשלים RPMI. ואז למקם 100 מיקרוגרם של pcDNA3 פלסמיד בצינור.
מוסיפים נתרן אצטט ב- pH 5.3 לצינור. לאחר מכן, להוסיף 2.5 כרכים של 100%אתנול לתערובת פלסמיד. ואז להחגירה את תערובת פלסמיד לילה במינוס 20 מעלות צלזיוס.
24 שעות לאחר ציפוי תאי BW, לאסוף את התאים בשני צינורות 50 מיליליטר. ואז צנטריפוגה התאים ב 515 גרם של במשך חמש דקות, ולהשליך את העל טבעי. יש להשתמש שוב ב- RPMI פלוטון ללא תוספות ולחזור על הצנטריפוגה.
תן שימוש חוזר את גלולה וכתוצאה מכך 1 מיליליטר של RPMI ללא תוספות. מעבירים את גלולת התלייה ל-4 ס"מ על הקרח. צנטריפוגה הפלסמיד שעבר משקעים אתנול.
ואז לשטוף את הפלסמיד עם מיליליטר אחד של 70% אתנול. ולחזור על צנטריפוגה לעוד 20 דקות. הסר את כל האתנול, ולאפשר את גלולה להתייבש חלקית.
לאחר מכן להשתמש שוב את גלולה ב 100 microliters של RPMI שחומם מראש, ללא תוספות. לאחר מכן, מוסיפים את הפלסמיד המתווסף לתאים בקובט. דגירה התאים על קרח במשך חמש דקות.
לאחר מכן, אלקטרופוראט התאים. ואז להעביר את התאים אלקטרופולד לצינור 50 מיליליטר. מוסיפים 50 מיליליטר של מדיום שלם לצינור וצנטריפוגה במשך חמש דקות, ב 515 גרם.
השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש את התאים ב-50 מיליליטר של מדיום שלם. לאחר מכן צלחת התאים ב 24 גם מנות תרבות, ו דגירה התאים במשך 48 שעות. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של מדיום מלא, בתוספת 10 מיליגרם למיליליטר של G418 לכל באר.
48 שעות לאחר מכן, להשליך מיליליטר אחד של הנפח העליון של כל באר. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של מדיום שלם בתוספת חמישה מיליגרם למיליליטר של G418 לכל באר. השתמש 50, 000 תאי BW מומרים עם המטרות הרצויות שלהם, באר אחת של צלחת 96 באר.
דגירה הצלחת במשך 48 שעות. ואז להקפיא את הצלחת במינוס 20 מעלות צלזיוס. מצפים צלחת ELISA עם נוגדן נגד עכבר IL-2.
מניחים 05 מיקרוגרם של IL-2 נגד עכבר, בנפח של 50 מיקרוליטרים של PBS בכל באר. דגירה צלחת מצופה לילה בארבע מעלות צלזיוס. השתמש בתקופת דגירה קצרה ב 37 מעלות צלזיוס, כדי להפשיר את תאי BW הקפואים, שהיו בעבר דגירה עם המטרות שלהם.
ואז צנטריפוגה הצלחת, ולהעביר 100 microliters של supernatant מכל באר לצלחת ELISA מצופה מראש. ודגירה ב37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר מכן להוסיף ביוטין נגד עכבר IL-2 לצלחת ELISA.
לאחר הדגירה והכביסה, מוסיפים לצלחת סטרפטבידין מצומד HRP. לאחר הדגירה והכביסה, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרון המצע TMB, לכל באר של צלחת ELISA. לבסוף לקרוא את צלחת ELISA ב 650 ננומטר.
בדוגמה זו, תאי CLL היו טרום דגירה עם נוגדנים שונים נגד CD20. ולאחר מכן הדגירה במשותף עם תאי BW מנופים המבטאים את קולטני Fc CD16, לפני ניתוח עם ELISA. לאחר ניתוח עם ELISA התוצאות כומתו.
רמות הצפיפות האופטית הוסבו לריכוזי עכבר IL-2, בהתבסס על העקומה הסטנדרטית. בניסוי נוסף, מינונים שונים של נוגדנים נגד CD20 היו טרום דגירה עם תאי CLL. ואז דגירה עם תאי BW מנופחים.
החלקיק מכיל ארבעה חלקים עיקריים. שיבוט, חילוף של תאי BW, הפעלה ו ELISA. יש לאמת כל אחד מהחלקים באופן עצמאי.
בעקבות הליך זה, ניסויים נוספים יכולים להתבצע עם תאים המבטאים את הקולטנים הא אנדוגניים, כגון הרג חומצות עם תאי NK כדי ללמוד אינטראקציות עם קולטני תא NK. השתמשנו במערכת זו כדי לגלות ליגנדים חדשים של קולטני תא NK. לדוגמה, hemagglutinin הוא ליגנד של NKp46, ו- PVL הוא ליגנד של TG.
