שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום המכונוביולוגיה, כגון כיצד כוחות מועברים ומו חשים בתוך תאים, כמו גם בין תאים וסביבתם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת גישה למידע בקנה מידה מולקולרי לגבי האופן שבו חלבונים מגיבים לכוחות מכניים בתוך ההקשר המקומי של התא החי. למרות שיטה זו הוחלה במיוחד על לימוד וינקולין חלבון הידבקות המוקד, זה יכול להיות מיושם גם חלבונים אחרים רגישים מכנית, כגון טאלין, cadherins או nesprin.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כמו הגדרת הדמיה נכונה קשה אך הכרחי להצלחת הניתוח. התחל הליך זה עם ביטוי יציב של מבנה חיישן המתח בסוג התא הרצוי, כמפורט בפרוטוקול הטקסט. כדי להכין מצעים עבור זריעת תאים, לרכוש ארבע מנות 35 מילימטר זכוכית תחתית.
עבודה במכסה המנוע של תאים, בצינור חרוט 15 מיליליטר, לעשות ארבעה מיליליטר של 10 מיקרוגרם למיליליטר fibronectin בתמיסת מלח סטרילית פוספט-buffered, או PBS. בעדינות להפוך את הצינור פעם אחת לערבב ולתת את הפתרון לשבת במשך חמש דקות במכסה המנוע של תא התרבות. ואז פיפטה מיליליטר אחד של פתרון פיברונקין על כל צלחת עם תחתית זכוכית.
השאירו את תספורת הפיברונאטין על הכלים למשך שעה בטמפרטורת החדר או למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. ואז לספירה את פתרון פיברונאטין ולשטוף פעם אחת עם PBS. השאירו מיליליטר אחד של PBS על הכלים עד התאים מוכנים לזרוע.
לאחר ספירת התאים, זרע 30, 000 תאים על כל צלחת זכוכית מצופה fibronectin עם המדיה המלאה המתאימה עבור נפח סופי של 1.5 מיליליטר. אפשר לתאים להתפשט במשך ארבע שעות לאחר הזריעה. שעתיים של התפשטות, שאפו את מדיית הצמיחה ושטוף פעם אחת במדיה הדמיה.
השאירו 1.5 מיליליטר של אמצעי ההדמיה. חמם את המיקרוסקופ כמתואר בפרוטוקול הטקסט לפני תחילת הכיול. כדי לכייל את לייזר FRAP, פתח תחילה את חלון תצורת הלייזר.
קבעו את הגדרת התאורה להגדרות תאורת FRAP המתאימות לחשיפת לייזר לדגימה. לאחר מכן הגדר את הגדרת התאורה להגדרות התאורה המתאימות להדמיה רק של פלואורופור המקבל. בחר את המטרה לכיול תחת הגדרת מערכת קואורדינטות.
בטל את הסימון של לחץ ידנית על נקודות כיול וסמן את האפשרות הצג תמונות במהלך הכיול. הגדר את זמן השתהות ל- 10,000 מיקרו-שניות ואת מספר הפולסים ל- 100. עכשיו למקם את שקופית הכיול, עשוי אתידיום ברומיד אטום בין שקופית זכוכית להחליק כיסוי, לתוך מתאם הבמה עם צד החלקת המכסה למטה.
השתמש בהגדרות התאורה של המקבל כדי להתמקד על פני השטח של השקופית, הניתנים לזיהוי כמישור המוקד עם האות הבהיר ביותר. פגמים קטנים ב ציפוי יהיה גלוי כדי לסייע בהתמקדות. הזז את השקופית לאזור עם פלואורסצנטיות אחידה לאורך מישור ההדמיה.
לחץ על צור הגדרה עבור הכיול הראשון או על הגדרת העדכון עבור הכיולים הבאים. התוכנה תאתר את תהליך הכיול, תלבין ותזהה באופן אוטומטי את מיקום הנקודה הלבנה. להבטיח כיול מוצלח על ידי הערכת התמונה הסופית, אשר תהיה רשת של שלוש על שלוש נקודות מולבן כי צריך להיות מופץ באופן שווה בפוקוס.
שמור את תמונת הכיול לעיון עתידי. הסר את שקופית הכיול ואחסן בבטחה. הכיול צריך להתבצע לפני תחילת כל ניסוי, אך אין צורך לבצע אותו בין דגימות.
הכינו את מערך המיקרוסקופיה להדמיית תאים חיים, רצוי עם שלב מחומם ואובייקטיבי, כמו גם בקרת פחמן דו חמצני. אפשר לצייד במשך 20 דקות. עכשיו למקם את אחת הדגימות שנוצר של תאים המבטאים את חיישן המתח לתוך מחזיק מיקרוסקופ להדמיה.
אפשר לתאים לצייד במשך 10 דקות. כדי להבטיח את בריאותם של התאים בתמונה, לשמור על הטמפרטורה ב 37 מעלות צלזיוס בתא ההדמיה. השתמש במשאבה פריסטולית כדי להעביר 5%פחמן דו חמצני לח מעל הדגימות ב 15 מיליליטר לדקה כדי לשמור על ה- pH.
פתח את הכלי רכישה רב-ממדית, או MDA, והגדר אותו עם פרמטרי דימות FRET, כולל ערכות המסננים השונות. שמור מד"א זה בתיקיה הניסיונית בשם MDA_FRET_date. הגדר מד"א נוסף עם פרמטרי הדמיית FRAP, כולל ערכות המסננים השונות, הגדרות Timelapse ואת היומן לדופק את הלייזר לאחר רכישת טרום אקונומיקה.
שמור מד"א זה בתיקיה הניסיונית בשם MDA_FRAP_date. בסרגל הכלים בחלק העליון של המסך, בחר יומן, התחל הקלטה. פתח את חלון מד"א, טען MDA_FRET_date המדינה ולחץ על רכוש.
לאחר מכן טען MDA_FRAP_date המדינה ולחץ על רכוש. בסוף הרכישה, בסרגל הכלים בחלק העליון של המסך, בחר יומן, הפסק הקלטה. שמור יומן זה בתיקיה הניסיונית בשם FRETFRAP_date והוסיף אותו לסרגל כלים לגישה נוחה.
סגור את חלון מד"א. נווט בדגימה באמצעות רכישת התמונה תחת רכישה, רכישה עם זמן חשיפה מינימלי ומסנן צפיפות נייטרלית כדי לזהות את תאי העניין. הגדר פוקוס אוטומטי רציף על-ידי ניווט להתקנים, מוקד.
התמקד ידנית בדגימה עד להגעה למישור ההדמיה הנכון. לחץ על הגדר מוקד רציף והמתן להתאמת המערכת. לאחר שהמערכת מתאימה את עצמה, לחץ על התחל התמקדות רציפה.
לאחר מכן מצא תא המבטא את חיישן המתח עם לוקליזציה ברורה למבנה מעניין והצמד תמונה. צייר אזור מלבני של עניין, או ROI, כדי להדגיש היכן להלבין. אחסן מיקום זה של ROI.
עכשיו לאתחל FRETFRAP_date יומן, אשר יתחיל את הרכישה של תמונות FRET, ואחריו אתחול של timelapse FRAP. חזור על שלבים אלה עד לרכש של 10 עד 15 ערכות תמונות. לאחר מכן נתח את נתוני FRET-FRAP כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
להלן תוצאות מייצגות להדמיית FRET של חיישן המתח של הוינקולין, לאחר פילוח ומסכות לבידוד הידבקויות מוקדיות. וריאציה מרחבית של עומס וינקולין ניתן לראות על פני התא. הדמיה וניתוח FRAP יכולים להיות מושפעים מיציבות הידבקות מוקד.
הידבקות מוקד כי הוא translocating במהירות במהלך תקופת ההדמיה יכול להיות קשה לעקוב במדויק. לעתים קרובות זה מצוין על ידי עקומת FRAP המכילה הפסקות ובלתי ניתן להפרכה. עבור וינקולין מסוג פראי, יש מתאם הפוך בין עומס החלבון לקצב התחלופה, המציין כי וינקולין התייצב בכוח.
הצגת מוטציה בווינקולין כדי להשפיע על הכריכה שלה טאלין תוצאות היפוך של המתאם, המציין כי וינקולין שאינו מסוגל לאגד טלין הוא התערער בכוח. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין דגימות כראוי, להבטיח כי התאים מבטאים את החיישן ברמות אנדוגני ולבחור פרמטרי הדמיה בזהירות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו immunofluorescence, מדידת דינמיקה בקנה מידה תאי או תאים מאתגרים עם מעכבים שונים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כיצד חלבון העניין אינטראקציה עם רכיבים תת תאיים אחרים כדי לתאם את התגובה לכוח.
