המעבדה שלי כבר לומדת את התפקיד של מסלול היפו בסרטן השד והריאות, ולאחרונה, פיתחנו biosensor הרומן כדי לפקח על פעילות איתות היפופוטם. שיטה זו יכולה לשמש כדי לענות על שאלות מפתח על רשתות איתות סלולרי, כגון כיצד מסלול היפו מגיב לגורמים וכיצד הוא מקיים אינטראקציה עם מסלולי איתות אחרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא הרגישות הגדולה שלה וגם את המספר הגדול של הדגימות ניתן לעבד במהירות ובו זמנית.
טכניקה זו יש יישומים מגוונים במחקר בסיסי ותרגום כדי לחקור את הרגולטורים של מסלול איתות היפו הן במבחנה והן במבחנה. בתור התחלה, מיני הכנה LATS-BS plasmids טרי מתרבות נוזלית חיידקים DH5-אלפא. שעה לפני ההטעה, שאפו את המדיום מהצלחת, והוסיפו 500 מיקרוליטרים של צמיחה בינונית לכל באר.
נקודה חשובה אחת היא כי BIOSENSor LATS חייב להיות מוכן טרי על מנת לקבל ביטוי מקסימלי ופעילות. כמו כן, מומלץ תמיד להשתמש ברגולטור במעלה הזרם של מסלול היפו, כגון MSD, כבקרה חיובית בעת ביצוע בדיקות לוציפראז. לאחר מכן, להחזיר את התאים לאנקובטור.
לאחר מכן, הכינו פתרון א', פתרון דנ"א ופתרון ב', רהט דואלי המבוסס על פולימר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, מיד להוסיף פתרון B לפתרון A, בעדינות pipette למעלה ולמטה לערבב. הדגירה את המדגם בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות כדי לאפשר קומפלקסים transfection להיווצר.
לאחר מכן מוסיפים את הנפח הכולל של קומפלקסים transfection טיפה חכם לכל באר של הצלחת עם מערבולת עדינה. דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, הסר את המדיה המכילה את ההטרמפקציה והחלף אותה במדיה שלמה ורעננה.
ואז לתרבת את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ליום אחד יותר. מדללים כמות מתאימה של חיץ תזה פסיבי פי 5 עם מים מזוקקים. לאחר מכן, שאף לחלוטין את התקשורת מהצלחת.
מוסיפים מיליליטר אחד של PBS לכל באר, ומערבבים את הצלחת בעדינות כדי להסיר תאים מנותקים ומדיית צמיחה שיורית. ואז שאף PBS לחלוטין. לאחר מכן, להוסיף 250 microliters של 1xPLB לכל באר.
מניחים את צלחת התרבות על פלטפורמת נדנדה במשך 15 דקות כדי להבטיח כיסוי שווה של monolayer התא עם PLB. לאחר מכן, להעביר את lysate לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. מוציאים את ה-LAR-2 מאחסון של 80 מעלות צלזיוס, ומאיים אותו לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הכינו את רניה לכמות מתאימה של תדהמה. הוסף את הריג'נט לזיהוי רנילה למצע 50x ואת המאגר שלו. לאחר מכן, מחלקים 10 מיקרוליטרים של כל תא lysate לתוך צינורות 1.5 מיליליטר.
לאחר מכן, תכנת מד זוהר לביצוע השהיה של שתי שניות לפני המדידה, ולאחר מכן תקופת מדידה של 10 שניות. בזהירות, להעביר 20 microliters של LAR-2 reagent לתוך צינור אחד, במהירות פיפטה למעלה ולמטה לערבב. לאחר מכן, מיד למקם את הצינור בלומינומטר וליזום את הקריאה.
לאחר הקריאה, להסיר את הצינור מדגם מן הזוהר, להוסיף 20 microliters של רנילה reagent, ו pipette למעלה ולמטה לערבב. לאחר מכן, מניחים את הדגימה בלומינומטר ויוזם את הקריאה הבאה. ראשית, תאי מודעות של תרבות, ניתוק, ספירה וצלחת HEK293 כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
ואז, שעה לפני ההתהפוכים, שאפו את התקשורת מהצלחת והחליפו אותה בחמישה מיליליטר של מדיה חדשה ומלאה. לבסוף, הוסיפו פתרון B מדולל לפתרון א', ו-pipette למעלה ולמטה כדי לערבב. לאחר מכן, הדגירה את המדגם בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות לפני הוספת הנפח הכולל של קומפלקסים transfection לצלחת, תוך מערבולת בעדינות.
דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, נסה וספיר את התאים. צלחת 10, 000 עד 20, 000 תאים לתוך כל באר של צלחת 96 באר בנפח כולל של 100 microliters של מדיה לגם.
לאחר מכן, הדגירה את התאים ליום אחד נוסף. שעה עד ארבע שעות לפני ביצוע בדיקה luciferase, להוסיף סוכנים פוטנציאל ויסות מסלול היפו, בריכוז סופי של 10 micromolar לכל באר. לאחר מכן, שאפו את המדיה לחלוטין מהתאים ושטפו את התאים בכל באר עם 100 מיקרוליטרים של PBS.
לאחר מכן, להוסיף 20 microliters של PLB לכל באר. מניחים את צלחת התרבות על פלטפורמת נדנדה במשך 15 דקות. לאחר מכן, להעביר 20 microliters של LAR-2 reagent לכל באר של הצלחת, ואת פיפטה למעלה ולמטה לערבב.
מיד לאחר מכן, מניחים את הצלחת לתוך לומינומטר קריאת צלחת וליזום את הקריאה. בחלק הראשון של פרוטוקול זה, LATS-BS היה cotransfected עם גנים שונים כדי להעריך את השפעתם על פעילות LATS קינאז. בפרוטוקול השני, LATS-BS נותב לתוך HEK293-Ad, והתאים הועברו לתוך לוחות 96 בארות.
40 שעות לאחר ההמרה, התאים טופלו עם מולקולות קטנות ידועות שונות של איתות היפו, ואחריו משגיח לוציפראז. כאשר מפרשים את התוצאות של בדיקות אלה, יש לציין כי חלבונים וטיפולים תרופתיים עשויים להפעיל מסלולי משוב המשפיעים על פעילות biosensor. ניסויים נוספים יהיו נחוצים כדי לאשר מערכת יחסים בין המועמד לבין מסלול איתות היפופוטם.
בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו כמותית בזמן אמת PCR, או כתם מערבי, ניתן להשתמש כדי לענות על שאלות נוספות על פעילות LATS קינאז. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הסרטן לחקור את הדינמיקה והפעילות של מסלול איתות LATS kinase והיפו בתהליכים ביולוגיים וביוכימיים רבים. אל תשכח כי תרופות להקרנה יכול להיות מסוכן מאוד, אמצעי זהירות מתאימים תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.
