רצף RNA חד-תאי הוא כלי רב עוצמה לחקר פרופילי שעתוק של תאים, במיוחד ברקמה הטרוגנית, כגון מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מספק שיטה לבודד גרעינים עבור רצף RNA בגרעין יחיד. באמצעות גרעינים במקום תאים, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על רקמות קשות לניתוק, כמו גם רקמה קפואה.
יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על לימוד שינויים ספציפיים לסוג התא בתאים בעקבות מחלה או פציעה. התחל הליך זה עם המתת חסד של העכבר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לבצע חתך לאורך הגוף כדי לחשוף את האיברים הפנימיים.
להוציא את העכבר על ידי משיכת האיברים הפנימיים מן חלל הגוף באמצעות מדפים. אין להשתמש במגבות נייר כדי לנקות את האזור או כדי להסיר איברים, שכן הדבר עלול לגרום למדבקים. בעזרת מספריים, חותכים את עמוד החוליות בין חוליות עמוד השדרה L2 ו-L3.
כדי להוציא את חוט השדרה, להתאים מזרק שלושה מיליליטר המכיל PBS קר כקרח עם מחט 25 מד 1/4 אינץ '. מניחים את קצה המחט לתוך הקצה המקראלי של עמוד החוליות. השתמש בשתי אצבעות כדי לצבוט את החוליות כדי ליצור חותם הדוק סביב קצה המחט, ולחץ על הבוכנה כדי להוציא את חוט השדרה rostrally.
מניחים את חוט השדרה בצלחת פטרי עם PBS קר כקרח. אם רק החלק המותני של החוט נדרש, לקצץ את החלקים sacral ובית החזה של חוט השדרה. בשלב זה, להקפיא את הרקמה ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס, או להשתמש מיד עבור תזה תא מכני דטרגנט כמתואר כאן, או תזה מכנית היפוטונית כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
כדי לקבוע תמוגה תאית מכנית דטרגנט, מניחים את חוט השדרה המותני ב homogenizer Dounce מקורר מראש ולהוסיף 500 microliters של חיץ תמוגה דטרגנט מקורר מראש. Dounce עם חמש משיכות של העלי רופף, A, ולאחר מכן חמש עד 10 משיכות של העלי הדוק, B. הימנע להרים את homogenizer מחוץ ת פתרון תמוגה בין משיכות, ולהימנע החדרת בועות. עכשיו, מניחים מסננת 40 מיקרון מעל צינור חרוט 50 מיליליטר מקורר מראש ורטוב מראש עם מיליליטר אחד של חיץ סוכרוז נמוך.
מוסיפים מיליליטר אחד של מאגר סוכרוז נמוך להומוגניזר Dounce המכיל את הגרעינים הגולמיים במאגר התמוגה, ומערבבים בעדינות על ידי צינורות פעמיים עד שלוש פעמים. מעבירים את הכנת הגרעינים הגולמיים מעל מסננת ה-40 מיקרון, לצינור חרוט 50 מיליליטר מקורר מראש. להעביר מאגר סוכרוז נמוך מיליליטר נוסף מעל מסננת 40 מיקרון, להביא את הנפח הסופי לשלושה מיליליטר של חיץ סוכרוז נמוך ו 500 microliters של מאגר תיזה.
חזור על שלבים אלה אם שילוב מיתרים מרובים, קירור באותו צינור חרוט. לאחר מכן, צנטריפוגה המדגם ב 3200 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. ברגע שהצנטריפוגה תושלם, תנקה את העל-טבעי.
אנחנו להשעות את הצבעים באמצעות שלושה מיליליטר של חיץ סוכרוז נמוך. בעדינות מערבולת כדי להסיר את גלולה מהקיר כדי להקל על ההתכוונות. לאחר שנתנו לדגימה לשבת על קרח במשך שתי דקות, מעבירים את ההשעיה לצינור אוק רידג'.
באמצעות homogenizer בהגדרה אחת, הומוגניזציה הגרעינים במאגר סוכרוז נמוך במשך 15 עד 30 שניות, שמירה על המדגם על קרח. לאחר מכן, השתמש פיפטה סרולוגית לשכבה 12.5 מיליליטר של חיץ סוכרוז צפיפות, מתחת הומוגנטי מאגר סוכרוז נמוך, דואג לא ליצור בועה שמשבשת את שכבות הצפיפות. צנטריפוגה הצינורות ב 3200 פעמים G, במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר שהצנטריפוגה הושלמה, מיד תנקה את העל-טבעי בתנועה מהבהבת. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להסיר באופן מיידי את צינור אוק רידג' מהצנטריפוגה, ולפענח במהירות את העל-טבעי. באמצעות 100 מיקרוליטרים למיליליטר אחד של פתרון ההתפלה מחדש, אנו משהים את הגרעינים שנותרו על הקיר.
הימנעו מהזעף שנותר עם ההכנה המבוססת על חומר ניקוי. כישלון לעשות צעדים אלה במהירות יכול לגרום להכנת גרעינים עם פסולת הסלולר עודף, או מיאלין, אשר יכול לעכב במורד הזרם רצף RNA גרעין יחיד. מסננים את הגרעינים דרך מסננת בגודל נקבוביות של 30 עד 35 מיקרון ואוסף בצינור מקורר מראש.
לקבוע את תפוקת הגרעינים, באמצעות hemocytometer לספור גרעינים תחת מטרה 10 x, לפני שתמשיך רצף RNA גרעין יחיד, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שדה בהיר ותמונות epifluorescent של גרעינים, מבודד באמצעות פרוטוקול תמיסת מכני דטרגנט, מוצגים ב 10 x. גרעינים אלה מבודדים באופן לא משוחד, ומאפשרים חקר פרופילי ביטוי גנים אנדוגניים ברמה של תא בודד.
מוצג כאן, הוא העלילה tSNE נציג של רצף RNA גרעין יחיד, מתוך חוט השדרה המותני העכבר, באמצעות פלטפורמת אנקפסולציה טיפה מקבילה מאסיבית. גרעינים מבודדים מרקמה טרייה או קפואה יכולים לשמש לתהווים בפלטפורמות מסחריות ואקדמיות. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור פרופילי שעתוק ברמת התא הבודד, תוך שימוש ברקמות קשות לניתוק, כגון חוט השדרה, או אפילו רקמה קפואה, כגון חומר ביו-בנקאי.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב להפחית את משך הזמן בין המתת חסד תותבת הסלולר. יתר על כן, חשוב למזער בועות שהוכנסו לפתרונות מתזה סלולרית להתחדשות, ולקנות גרעיני חיות מחמד בזהירות. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש בגרעין עבור יישומים חלופיים, כגון מיון facs, כדי לבודד סוגי תאים ספציפיים.
