פרוטוקול זה יכול לסייע למדענים המעוניינים לחקור את התפקוד המולקולרי של אסטרוציטים אנושיים בנישה הטבעית שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת בידוד והעשרה של סוג תא מסוים, אסטרוציטים בוגרים מדגימות של רקמת מוח אנושית בתפזורת באמצעות מיון גרעינים המופעל על ידי פלואורסצנציה. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על בידוד סוגי תאים אחרים מהנאוקורטקס האנושי, כגון נוירונים ותאי אב של אוליגודנדרוציטים באמצעות נוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים מתאימים אחרים.
התחילו לנתח כ-200 עד 400 מיליגרם של רקמות מדגימת רקמת קליפת המוח הבוגרת הטרייה והקפואה של האדם. מניחים את הרקמה בתוך רקמת זכוכית בת שבעה מיליליטר המכילה ארבעה מיליליטרים של חיץ ליזה קר כקרח על קרח וטוחנים את הרקמה כ-50 פעמים. מעבירים את ההומוגנאט לצינור פוליפרופילן אולטרה-צנטריפוג' של 12 מיליליטר.
השתמשו בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי להוסיף 6.5 מיליליטרים של חיץ סוכרוז קר כקרח לתחתית הצינור האולטרה-צנטריפוג' מבלי להפריע לממשק בין הסוכרוז לרקמה הומוגנטית. כדי לאסוף את הגרעינים, אולטרה-סנטריפו את הליסאט למשך שעה אחת ב-101, 814 פעמים G ושאפו בזהירות את הסופרנטנט ואת הפסולת מבלי להפריע לכדור. הוסיפו 0.1% BSA ב-PBS לצינור האולטרה-צנטריפוג' לדגירה של 10 דקות על קרח לפני החייאה של גלולת הגרעינים.
לאחר מכן, השתמש בכחול טריפאן כדי לדמיין את הגרעינים השלמים תחת מיקרוסקופ אור וכדי להבטיח שהריכוז יהיה מעל 10 עד הגרעינים החמישיים למיליליטר למיון המופעל על ידי פלואורסצנציה של הגרעינים המבודדים, הוסף כ-20 מיקרוליטרים של הדגימה המוחזרת לתמיסת נוגדנים המכילה נוגדן אלקסה פלואור 555 מצומד לעכבר אנטי-NeuN. הוסיפו כ-20 מיקרוליטרים של הדגימה המוחזרת לתמיסת נוגדנים המכילה נוגדן נגד PAX6 של עכבר מצומד APC. לאחר דגירה של שעה בארבע מעלות צלזיוס עם רעידות, מוגנות מפני אור, הוסיפו DAPI ביחס של 1:1000 לכל הדגימות והבקרות.
כדי לכלול גרעינים בגודל המתאים וכדי לא לכלול תאי דם אדומים ופסולת, השתמש בצינור בקרה כדי לשער את התאים לפי אזורי הפיזור הקדמיים והצדדיים שלהם. כדי לבחור את אוכלוסיית גרעיני הסינגלט, שער לפי אזור פיזור קדימה לעומת רוחב פיזור קדימה או גובה ושטח פיזור צד לעומת רוחב או גובה פיזור צד. שער על ידי DAPI כך שיכלול רק את סינגלי הגרעינים השלמים ולא לכלול פסולת וכפולות.
לאחר גידור על פי כל פקדי פלואורסצנציה נוספים, הפעל את דגימת הבקרה של DAPI בלבד. הפעל את בקרת ה-NeuN Alexa fluor 555 בלבד כדי לקבוע את הניתוק עבור הכתם החיובי של NeuN בערוץ אלקסה פלואור 555. הפעל את פקד ה-APC של PAX6 בלבד כדי לקבוע את הניתוק עבור הכתם החיובי של PAX6 בתעלת ה-APC.
לאחר הפעלת כל הבקרות, שערו את התאים החיוביים ל-NeuN כדי לאסוף את הנוירונים ולשער את התאים החיוביים ל-PAX6 עם האוכלוסייה השלילית של NeuN כדי לאסוף את האסטרוציטים. שער ואסוף אוכלוסיות גליה נוספות בעלות עניין מאוכלוסיית PAX6-שלילית של NeuN. לריצוף RNA של גרעין יחיד בתפזורת, לאחר איסוף 50, 000 עד 500, 000 גרעינים ב-0.04% PBS בתוספת BSA, הוסיפו לדגימה שני מיליליטרים של תמיסת סוכרוז, 50 מיקרוליטרים של סידן כלוריד טוחן אחד, ו-30 מיקרוליטרים של אצטט מגנזיום טוחן אחד.
הביאו את הנפח הסופי של המתלים עד 10 מיליליטר עם PBS. ערבבו את תכולת הצינור על ידי היפוך ודגרו את התגובה על הקרח במשך 15 דקות. גלול את הגרעינים על ידי צנטריפוגה ו resuspened הגרעינים במיליליטר אחד של RNA חילוץ מגיב.
לאחר מכן, מערבולת את הצינור, מקפיאים את הדגימה על קרח יבש, ומאחסנים את הגרעינים במינוס 80 מעלות צלזיוס. עבור ריצוף כרומטין מקובל על גרעין יחיד בתפזורת, אספו 50, 000 עד 75, 000 גרעינים לתוך 0.04%PBS עם תוספת BSA בצינור מיקרו-צנטריפוגה המצופה ב-5%BSA והקפיאו את הגרעינים עד לניתוח במורד הזרם. ניתן למיין אוכלוסיות של גרעינים עצביים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים מדגימת ניאוקורטקס אנושית טמפורלית קפואה ורעננה לאחר המוות כפי שהודגם.
מחקרי ריצוף RNA של גרעין יחיד נתנו עדיפות נוספת ל-PAX6 כגורם שעתוק גרעיני בעל ביטוי דיפרנציאלי עליון הן בתת-אוכלוסיות של אסטרוציטים בוגרים פרוטופלסמיים והן בסיביים. לאחר המיון, ניתן לאפיין שינויים בתעתיק ספציפי לסוג התא בניאוקורטקס האפילפסיה הפתולוגית הראשונית. בניתוח זה, ניתוחי תעתיק אישרו כי האוכלוסיות החיוביות ל-NeuN-negative של PAX6 הועשרו בחוזקה עבור סמני פאנאסטרוציטים והתרוקנו עבור סמנים עצביים.
ניתן להשתמש בכתם אימונופלואורסצנטי כדי לאשר את הלוקליזציה המשותפת של PAX6 עם חלבון חומצי מפרבר גלי באסטרוציטים קליפתיים אנושיים. מרווחים קצרים יותר לאחר המוות קשורים להתאוששות גרעינים שלמים יותר מדגימות רקמות טריות. ניתן לשחזר תפוקה גבוהה של גרעינים שלמים מרקמה קפואה עד 24 שעות לאחר המוות, אך ב-30 שעות ניתן לשחזר מעט מאוד גרעינים שלמים.
הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא לקבל את האוכלוסייה החיובית PAX6 מאוכלוסיית NeuN-negative, מכיוון שיש נוירונים שמבטאים גם את PAX6, ואנחנו רוצים להחריג אותם. טכניקה זו גם אפשרה את המחקר של אסטרוציטים בדגימות מוח כירורגיות אפילפסיה, מה שהבהיר עוד יותר את הדיסרגולציה המולקולרית של אסטרוציטים אנושיים בהקשר של נישה פתולוגית ספציפית.
