MUB40 הוא סמן נויטרופילים חדשני, אשר נקשר לקטופרין ומאפשר זיהוי ספציפי בדגימה של רקמת יונקים אנושית וכל נבדק עד כה. תיוג נויטרופילים באמצעות MUB40 הוא קל, מהיר וספי. זה עכשיו בשימוש נרחב במעבדה שלנו ואת המשמעות של טכניקה זו להרחיב לקראת אבחון של מחלות דלקתיות.
כדי להתחיל, הכינו פתרונות 1, 2 ו-3 על פי פרוטוקול הטקסט, והצבו אותם בקבינט אנוקסי בן לילה. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות של דם שנאסף ב 650 גרם במשך 20 דקות כדי להפריד את התאים משבר הפלזמה. מבלי להפריע לדם המופרד, להעביר את הצינורות לארון אנוקסי ולהעביר את שברי הפלזמה לצינור חרוט 50 מיליליטר.
לאחר מכן להסיר את הצינור של פלזמה מן הארון אנוקסי צנטריפוגה זה ב 2900 גרם במשך 20 דקות. דואג לא לשבש את טסיות הדם גלולה, להעביר את הצינור לארון אנוקסי פיפטה טסיות פלזמה עניים לתוך צינור טרי 50 מיליליטר. באמצעות צינורות איסוף הדם, לשלב את תאי הדם האדומים בצינור חרוט 50 מיליליטר.
לאחר מכן, להוסיף 0.9% פתרון נתרן כלורי עד נפח הכולל מגיע 44 מיליליטר, ולהוסיף שישה מיליליטר של 6%dextran. הופכים את הצינור 10 עד 20 פעמים כדי לערבב בעדינות את תערובת הדם והדקסטרן, ולאפשר לצינור להזעים לפחות 30 דקות. בעוד מעים צינור, להכין שיפוע פרקול על ידי הוספת 4.2 מיליליטר של פתרון פרקול ל 5.8 מיליליטר של פלזמה, ולהפוך את הצינור לערבב.
לאחר מכן, לאסוף את נויטרופילים המכילים את החלק העליון של dextran, דואג לא פיפטה תאי דם אדומים. הדקו את מכסה הבורג, הסירו את צינור הדקסטרן מהארון האנוקסי, וצנטריפוגו את הצינור ב-300 גרם למשך 10 דקות. דואג לא להפריע לתאים גלולה, למקם את הצינור בחזרה בארון אנוקסי.
לאחר מכן, להסיר את הנוזל על ידי צינורות. בעדינות resuspend גלולה במיליליטר אחד של פלזמה. הוסף באיטיות את התאים המתווסתים לראש הפתרון של Percoll.
הסר בזהירות את צינור הפתרון של Percoll מהארון האנוקסי וצנטריפוג אותו ב 800 גרם במשך 20 דקות כדי להפריד PBMCs מנויטרופילים. לאחר מכן, הכינו 14 מיליליטר של פתרון חיץ כביסה בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, מניחים את צינור פרקול בארון האנוקסי.
השתמש פיפטה כדי להסיר את פרקול ו PBMCs ולתלות מחדש את גלולת המכיל נויטרופילים במיליליטר אחד של פתרון חיץ כביסה. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים לתאים המתווסכים מחדש. מערבבים בעדינות ומדגרים את התאים ואת חרוזים לפחות 15 דקות.
לאחר מכן, לשטוף עמוד הפרדה פעמיים, עם שני מיליליטר של חיץ כביסה. בעוד מחזיק חדש, צינור חרוט 15 מיליליטר מתחת לעמודה, לאט pipette תערובת תאי הדם האדומים נויטרופילים דרך העמוד. הזרימה דרך מהעמוד צריך להיות מעונן ולאבד את צבעו האדום, המאשר את ההפרדה המוחלטת של נויטרופילים מתאי הדם האדומים הנותרים.
הוסף שני מיליליטר של חיץ כביסה לראש העמוד ולאסוף את הזרימה דרך באותו צינור. עד סוף שטיפה זו, הזרימה דרך צריך להיות ברור. מערבבים בעדינות את צינור האיסוף כדי להבטיח שהנויטרופילים מופצים באופן שווה.
ואז אסף 10 מיקרוליטרים של הזרימה דרך מספירת תאים. לאחר מכן, להסיר את הצינור נויטרופילים מן הארון אנוקסי צנטריפוגה הצינור ב 300 גרם במשך 20 דקות. מניחים את נויטרופילים מעים בחזרה לתוך הארון אנוקסי ולהסיר את חיץ הכביסה באמצעות צינורות.
לאחר מכן, תן שוב את גלולת הפלזמה. מוסיפים מיקרוליטר אחד של RI-MUB40-Cy5 למיליליטר אחד של מדיום RPMI-1640, ללא אדום פנול, ומערבבים באמצעות צינורות. לאחר מכן, להוסיף microliter אחד של פתרון FMLP ו pipette לערבב.
מעבירים את התערובת לתבשיל מיקרוסקופיה בתחתית הזכוכית. לאחר מכן מוסיפים נפח מתאים של תאים מטוהרים לצלחת. לבסוף, מניחים את המנה במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך ומתחילים ברכישת תמונות.
בפרוטוקול זה, MUB40 שימש על תאים חיים כדי לזהות הפרשת נויטרופילים על סימולציה עם FMLP. הדינמיקה של שחרור תוכן הגרנול, כולל לקטופרין, עשויה להיות חזותית לאורך זמן, כאן במגנטה. MUB40 ניתן להשתמש בנוסף על נויטרופילים קבועים.
כאן, חרוזים פלואורסצנטיים phagocytizing בסדרה מתוזמן. התוכן של גרנול נויטרופילים מסומן כאן בכחול. הנויטרופילים הראו מעט מאוד כתמי תאים בנקודות זמן מוקדמות ובהדרגה, תיוג RI-MUB40 גדל עם הזמן, הן על קרום הפלזמה והן על פני השטח של חרוזים.
MUB40 עשוי לשמש גם על רקמות דלקתיות קבועות כדי לזהות נויטרופילים במיוחד, כפי שמוצג בדמויות הטקסט. אנו מתארים כאן את הליך טיהור נויטרופילים, מיושם באופן שגרתי במעבדה שלנו. כל שיטה אחרת מתאימה, תיוג MUB40-Cy5 עדיין יעבוד.
נויטרופילים עשויים להיות מסומנים במיוחד עם MUB40 לאחר טיהור, או ישירות ברקמה מודלקת מחולים או מודלים של בעלי חיים. מספר נגזרות MUB40 תוכננו להרחיב את השימוש בו. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקר בתחום הדלקת, לחקור גיוס נויטרופילים והפעלה במחלות דלקתיות.
