שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה כגון מנגנוני ויסות גנים ויחסי סיבה ותוצאה בין אלמנטים רגולטוריים כרומטינים שונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי בפעם הראשונה ניתן מודול כרומטין לוקוסים עם אנזימים אנדוגני רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו ייאבקו כי תרבות העכבר ESL קשה מטבעה עבור אלה שלא הוכשרו בטכניקה.
הדגמה נוספת של שיטה זו היא קריטית כמו צעדים זיהום ויראלי התא קשה ללמוד. החוקר חייב לתזמן שני קווים נפרדים של תרבות התא ויש צורך לפקח על הבטיחות בדריכות במהלך שלבים אלה. כדי להתחיל את הפרוטוקול, מעבר 18 מיליון של 293T תאי HEK לכל צלחת 50 ס"מ.
שאפו את המדיה הישנה והוסיפו 10 מיליליטר של תמיסת מלח אחת של X פוספט, או PBS. שאפו את ה-PBS והוסיפו 3 מיליליטר של 0.05% טריפסין. דגירה התאים ב טריפסין במשך שמונה דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
רוק והקשה על התאים באמצע הדגירה. למחרת, כאשר התאים הגיעו 60 עד 80%confluency, לבצע פוליאתילנימין, או PEI, transfection. לאחר מכן, מערבבים בעדינות את הדנ"א, ה-PEI ומדיית ההמרה בצינור חרוטי של 15 מיליליטר.
הדגירה את המדגם בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאחר הדגירה, מוסיפים את הפתרון dropwise לצלחת 15 ס"מ. לאחר מכן, להדגים את המדגם במשך 16 שעות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
למחרת, שאפו את התקשורת והחליפו אותה בעדינות במדיה 293 HEK טרייה ורעננה לצלחות של 15 ס"מ. לאחר חילופי התקשורת, חגירה התאים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך 48 שעות. לספור את התאים עם המוציטומטר.
מעבר שהוכן בעבר mESC לפורמט צלחת 12 גם עם 100, 000 תאים לגם יום אחד לפני ההדבקה. לתאים הגדלים בתבנית של 10 ס"מ, שאפו את המדיה הישנה, הוסיפו חמישה מיליליטר של X PBS אחד, שאפו את ה-PBS והוסיפו מיליליטר אחד של 0.25%trypsin. דגירה התאים טריפסין במשך שמונה דקות ב 37 מעלות צלזיוס וסלע להקיש על התאים באמצע הדגירה.
48 שעות לאחר חילופי התקשורת, להסיר ולהעביר את העל-טבעי של תאי HEK 293T לצינור חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה supernatant ב 300 פעמים G במשך חמש דקות כדי גלולה פסולת התא. לאחר מכן, לסנן את supernatant דרך קרום 0.45 מיקרון.
לרכז את הנגיף באמצעות אולטרהצנטריפוגה עם רוטור SW32 ולסובב את המדגם ב 72, 000 פעמים G במשך שעתיים וחצי בארבע מעלות צלזיוס. בעוד הנגיף מתרכז תחת ultracentrifugation, לטפל mESC של ה-CIA בצלחת 12 גם עם גזע עוברי טרי או מדיה ES המכיל חמישה מיקרוגרם למיליליטר של פוליברין. כאשר ריכוז הנגיף סיים, בזהירות לשאפת את supernatant בזהירות להשעות את גלולת הנגיף ב 100 microliters של אחד X PBS, כדי למנוע בועות עודפות.
הוסף את הווירוס ואחד X PBS לצינור Microfuge 1.5 מיליליטר. מערבולת הצינור בהגדרה הנמוכה ביותר כדי להשעות את הנגיף באופן מלא. לסובב את הצינור בצנטריפוגה שולחן מיני במשך חמש עד 10 שניות כדי להסיר בועות.
הוסף 30 microliters של הנגיף לכל באר של צלחת 12 גם. מערבל את הצלחת ולאחר מכן צנטריפוגה הדגימות ב 1000 פעמים G במשך 20 דקות. מניחים את צלחת 12 באר בחזרה 37 מעלות צלזיוס אינקובטור לילה.
למחרת בבוקר, להחליף את התקשורת עם מדיה ES טרי ולאפשר זיהום להתקיים במשך 48 שעות. לאחר 48 שעות של זיהום, בחר עבור תאים ששלבו את פלסמיד ויראלי על ידי הוספת האנטיביוטיקה המתאימה. שנה את המדיה מדי יום.
שמור את מדיית הבחירה בתאים למשך 72 עד 96 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. המשך עם מגביל אפיגנטי כימי, או CEM, הכנה וטיפול על ידי השעיית אבקת CEM ודימתיל סולפוקסיד, או DMSO, לריכוז מלאי של מילימולר אחד וריכוז עבודה של 100 מיקרומולרים. לאחר התאים עברו בחירה במשך 72 עד 96 שעות, לפצל את mESC של לפורמט 12 גם עם 100, 000 תאים לגם.
אין לארוב את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. לאחר הדגירה, הכן פתרון מדיה של 100 ננומולרים CEM עם מדיה ES. השתמש בתקשורת כדי להאכיל את ה-CIA mESC עם מיליליטר אחד היטב.
שמור באר של תאים ללא כל CEM נוסף של לשמש פקד. לאחר מכן, שנה את המדיה על-ידי שאספירה של המדיה הישנה והוספת מיליליטר אחד לכל אגם CEM שהוכן טרי המכיל או מדיה ES ללא CEM כל 24 שעות למשך הניסוי. לאחר 48 שעות של טיפול CEM, תמונה התאים ללא טיפול CEM בתאים שטופלו 100 ננומולר CEM באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
צלם תמונות מייצגות באמצעות פאזה או שדה בהיר כדי לתעד את המורפולוגיה של mESC בהגדלה של פי 10 עד 40. התאים היו צריכים להיווצר סביב מושבות עם כמה תאים מובחנים. תחת ערוץ פלואורסצנטיות FITC, תמונה שני תנאי התא.
לאחר מכן, לבודד את הבקרה ואת CEM תאים מטופלים עבור cytometry זרימה על ידי שאפת התקשורת, לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של אחד X PBS, שאפת PBS והוספת 0.25 מיליליטר של 0.25% טריפסין עם EDTA במשך שמונה עד 10 דקות. ודא כי התאים כבר לא מקובצים בגושים גדולים דרך המיקרוסקופ באמצעות הגדלה 20 פעמים. אם נראה כי התאים אינם נמצאים בהשעיה של תא יחיד, יש ללטף אותם בעדינות למעלה ולמטה עם פיפטה P1000 כדי לנסות את התאים באופן מלא.
מרווה את הטריפסין עם מיליליטר אחד של מדיה טרייה ומאזר מחדש את התאים במהירות גבוהה עם פיפטה סרולוגית עד שהתאים נמצאים בהשעיה של תא יחיד. לאחר מכן, לסובב את התאים ב 300 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את העל-טבעי, שטפו את התאים ב-X PBS אחד, וכרו צנטריפוגה בתאים.
שאף את על-טבעי PBS ולחץ מחדש על גלולת התא ב-200 מיקרוליטרים של מאגר FACS. בצע cytometry זרימה על כ 50, 000 תאים עם תאים מושעים ולהפעיל את הדגימות במהירות נדן של סביב 5, 000 תאים לשנייה. לבסוף, יצא את הנתונים לניתוח נוסף.
תמונות פאזה של מערכת CEM ב- Oct4 locus ו- CIA mESC של הם בתמונה לאחר 48 שעות של טיפול עם 100 nanomolar של CEM23 או עם תאים מטופלים מצביעים על דיכוי GFP ספציפי. תמונות פלואורסצנטיות מציגות ביטוי GFP בהיר בתאי הבקרה וביטוי GFP מופחת ב- mESC המטופל ב- CEM23. ציטומטריית זרימה חשפה באופן עקבי ירידה של יותר מ-30% בביטוי GFP ב-CIA mESC שטופל ב-100 ננומולרים של CEM23 למשך 48 שעות.
אימונו-פציפציה כרומטין, או שבב, התגלה כי 48 שעות של טיפול עם 100 nanomolar של CEM23 ירד ברמה של H3K27ac על לוקוס היעד בהשוואה לתאי בקרה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות זהיר עם תאי גזע עובריים העכבר. אם הם יבדילו במהלך הפרוטוקול, התוצאות יבוטלים.
לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה הסינתטית לחקור את מנגנוני in vivo בגנום היונקים.
