גישה זו מציעה דרך יעילה להכניס אנטיגנים ויראליים אחרים לגנום HVT לפיתוח מהיר של חיסונים רקומביננטיים. יתרון מסוים של טכניקה זו הוא כי קלטת ביטוי GFP מחובר להוסיף הראשון עבור הדמיה קלה ולאחר מכן הוסר על ידי מערכת Cre-LoxP. ניתן להשתמש באותה גישה כדי להכניס גנים ויראליים יותר במקומות שונים של הגנום HVT, או וירוסים אחרים הרפס העופות לפיתוח חיסונים רקומביננטיים רב-תכליתיים.
הפגנת ההליך תהיה קייטי מופאט, מומחית למיון תאים. נה טאנג, יאויאו זאנג וגואנגגנג קו, מדענים מהמעבדה שלי. יום לפני transfection להכין פיברובלסטים עובר אפרוח כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.
זרעים 1.3 מיליון תאים ב 2.5 מיליליטר של בינוני לתוך כל באר של צלחת באר שש. לשנות את תאי CEF עם 0.5 מיקרוגרם כל אחד משני פלסמידים RNA מדריך Cas9, ומיקרוגרם אחד של פלסמיד התורם באמצעות reagent transfection המתאים על פי הוראות היצרן. דגירה התאים ב 38.5 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 12 שעות.
12 שעות לאחר transfection לדלל את מלאי וירוס HVT עם M199 תרבות בינוני לריכוז של 100, 000 פלאק להרכיב יחידות למיליליטר. הוסף 130 מיקרוליטרים של הנגיף המדולל לכל באר של תאים מנומרים. הגדר באר אחת של תאים לא פתורים כפקד שלילי והוסף את אותה כמות של וירוס.
דגירה התאים ב 38.5 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים. יום לפני המיון להכין שתי 96 צלחות גם על ידי זריעת 20, 000 תאים לתוך כל באר. שלושה ימים לאחר ההדבקה לאחזר את שש צלחות היטב המכיל את CEFs מדבק נגוע.
שאפו את המדיום מכל באר ושטוף את גיליון התאים ב- PBS. מוסיפים מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין-EDTA לכל באר ו דגירה התאים ב 38.5 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך כחמש דקות. לאחר מכן, תן שימוש חוזר בתאים עם 50 מיקרוליטרים של FBS והעבר את המתלה הזה לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
צנטריפוגה ב 200 פעמים כוח המשיכה במשך חמש דקות. תן שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של PBS המכיל 1%FBS. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים ולהתאים את צפיפות התאים למיליון תאים למיליליטר.
לאחר מכן, להעביר את התאים לצינור מיון פוליסטירן דרך כובע מסננת שלה. באמצעות סדרן תאים למיין את התאים הבודדים המבטאים GFP לתוך preseeded 96 צלחות באר. הדגירה את הצלחות עם התאים ממוינים ב 38.5 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך חמישה ימים.
לאחר חמישה ימים להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבדוק את 96 צלחות היטב ולסמן את בארות המכילות רובד חיובי GFP יחיד. נסה כל GFP חיובי היטב עם 50 microliters של טריפסין-EDTA במשך שלוש דקות. לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של מדיום תרבות כדי resuspend התאים ולהעביר את ההשעיה לתוך באר אחת של צלחת שש באר עם CEFs.
לאחר שלושה ימים להקפיא בקבוקון אחד של כל הדור הראשון של וירוסים רקומביננטיים במדיום המקפיא. אחסן את הווירוסים שנקטפו בחנקן נוזלי. לאסוף 100,000 תאים מכל הדור הראשון של וירוסים.
צנטריפוגה התאים ב 2, 000 סל"ד במשך חמש דקות, ולהשליך את העל טבעי. לאחסן את התאים ב 20 מעלות צלזיוס שלילי עד מוכן לבצע מיצוי DNA. כאשר מוכן לבצע מיצוי DNA להשתמש 50 microliters של חיץ מעך להפשיר מחדש את כדורי התא.
Lyse הדגימות ב 65 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות כדי להשבית את Proteinase K.Perform תגובת PCR עם שלושה פריימרים צומת הממשלה באמצעות מיקרוליטר אחד של כל דגימת DNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט. העמיסו שני מיקרוליטרים של מוצרי ההגברה לבירה אחת של 1% ג'ל לג'ל אלקטרופורזה. כדי להסיר את הגן GFP מן הווירוס רקומביננטי, להשתמש רהט transfection כדי לבצע חילוף שני microliters של פלסמיד ביטוי Recombinase לתוך צלחת ששת גם כי כבר preseeded עם תאי CEF.
12 שעות לאחר transfection להפשירו בקבוקון אחד של וירוס רקומביננטי מחנקן נוזלי. בעדינות resuspend את הנגיף ואת הזרע 50 microliters לתוך כל באר של תאים מפוסלים, הגדרת אחד גם את השליטה השלילית עם אותה כמות של וירוס. דגירה ב 38.5 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים.
72 שעות לאחר ההדבקה להכין את התאים למיון כפי שתואר קודם לכן. מיין את התאים הבודדים שאינם פלואורסצנטיים לתוך צלחת 96 בארות עם CEFs. לאחר מכן, נסה את הפלאקים שנבחרו והתאם מחדש את התאים המתאימים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
מעבירים חצי מהתאים לכל באר של צלחת 96 באר כי כבר preseeded עם CEFs כמו הדור השני. צנטריפוגה התאים הנותרים של כל שיבוט ב 200 פעמים כבידה במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את התאים ב-50 מיקרוליטרים של חיץ מעך לחילוץ דנ"א.
לאחר מכן, בצע PCR עם חמישה פריימרים צומת הממשלה באמצעות microliter אחד של תבנית DNA כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. בהתבסס על תוצאות PCR לבחור שלושה עד חמישה שיבוטים חיוביים של HVT רקומביננטי עבור מעברים נוספים ואימות. ראשית, להדביק CEFs עם הדור השני של HVT רקומביננטי בצלחת preseeded 24 היטב.
48 שעות לאחר ההדבקה להסיר את מדיום התרבות ולהוסיף 500 microliters של 4%paraformaldehyde ב PBS כדי לתקן את התאים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר מכן, להסיר את התיקון ולשטוף את שכבת התא שלוש פעמים עם PBS.
הסר את ה- PBS והוסף 500 מיקרוליטרים של 0.1%Triton X-100 כדי לחלחל לתאים. לאחר 15 דקות לשטוף את שכבת התא שלוש פעמים עם PBS. הוסף מאגר חסימה למשך שעה אחת כדי לחסום איגוד לא ספציפי.
לאחר מכן, לדלל את הנוגדן העיקרי נגד VP2 נוגדן חד שבטי HH7 או HVT נגוע סרום עוף באחד עד 200 במאגר חסימה. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי המדולל לכל באר ומדגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה. לשטוף את שכבת התא שלוש פעמים עם PBS.
לדלל את עז הנוגדן המשני נגד העכבר IgG Alexa 568 או עז נגד עוף IgG Alexa 488 באחד עד 200 במאגר חסימה. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של נוגדן משני מדולל לכל באר ומדגרים בטמפרטורת החדר במשך שעה. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.
השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבדוק את ביטוי החלבון. יום לפני התפשטות הנגיף זרע 2.6 מיליון תאי CEF לתוך כל בקבוק T25. להפשיר לפחות שלושה שיבוטים חיוביים ולהוסיף בקבוקון אחד של תאים או וירוסים לכל בקבוקון.
הדגירה את flasks ב 38.5 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני עד השפעה ציטופתית 50% נצפתה. הבא לקצור את התאים בשני מיליליטר של מדיום תרבות. להדביק 50 microliters לבקבוק T25 חדש כי היה preseeded עם תאי CEF לדור הבא.
המשיכו להעביר את הנגיף הרקומביננטי לפחות 15 דורות. באמצעות PCR לנתח כל דור של וירוסים לנוכחות של רצף VP2. באמצעות מיזם חיסוני עקיף לנתח כל דור של וירוסים של ביטוי VP2.
לאחר מיון תא יחיד הווירוס המטוהר המתקבל מנותח על ידי PCR צומת שלוש הממשלה, אשר מציג מוצר PCR בגודל הצפוי. לאחר כריתת כתב GFP על ידי Cre recombinase מעל 50% של הלוחות איבדו את ביטוי GFP שלהם. הפלאק המטוהר לאחר כריתת GFP מתקבל על ידי מיון תא יחיד והוא מאושר עוד יותר על ידי חמישה PCR צומת הממשלה אשר מראה את המוצר בגודל הצפוי.
ביטוי החלבון מאושר לאחר מכן על ידי בדיקת אימונפלואורסצנטיות עקיפה עם נוגדן חד שבטי ספציפי VP2 וסרום עוף נגד HVT. כצפוי, תאים נגועים HVT ההורה יכול להיות מוכתם רק על ידי סרום נגד HVT. בעוד תאים נגועים HVT רקומביננטי בבירור להראות את הביטוי של גן VP2.
כדי ליצור וירוס רקומביננטי שיעור transfection גבוה נדרש כדי למקסם את הסיכוי של הנגיף ואת הכנס להיפגש באותו תא לעריכה להתקיים. בעקבות הליך זה ניסויים בבעלי חיים יכולים להתבצע כדי להעריך את האימונוגניות ואת היעילות של החיסונים רקומביננטי. פיתוח חיסונים וקטוריים רב-לשוניים חדשים באמצעות פלטפורמת מערכת CRISPR/Cas9 המתוארת כאן יועיל מאוד לתעשיית העופות להגן מפני מחלות עופות מרובות.
