ويوفر هذا النهج طريقة فعالة لإدخال مستضدات فيروسية أخرى في جينوم HVT من أجل التطوير السريع لللقاحات المؤتلفة. بعض ميزة هذه التقنية هو أن يتم إرفاق كاسيت تعبير GFP إلى إدراج الأولى لتصور سهلة ومن ثم إزالتها بواسطة نظام Cre-LoxP. ويمكن استخدام نفس النهج لإدخال المزيد من الجينات الفيروسية في مواقع مختلفة من جينوم HVT، أو فيروسات الهربس الطيور الأخرى لتطوير لقاحات متعددة التكافؤ المؤتلف.
وسوف يكون إثبات الإجراء كاتي موفات، وهو خبير في فرز الخلايا. نا تانغ، يايواو تشانغ و غوانغانغ كو، علماء من مختبري. في اليوم السابق لعملية نقل الرحم إعداد الخلايا الليفية الجنين الفرخ كما هو مبين في بروتوكول النص.
بذور 1.3 مليون خلية في 2.5 ملليلتر من المتوسط في كل بئر من ستة بئر لوحة. Transfect الخلايا CEF مع 0.5 ميكروغرام كل من اثنين من دليل Cas9 RNA plasmids، وميكر واحد من plasmid المانحة باستخدام كاشف transfection المناسبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. احتضان الخلايا في 38.5 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 12 ساعة.
12 ساعة بعد transfection تمييع مخزون فيروس HVT مع M199 ثقافة المتوسطة إلى تركيز 100،000 لوحة تشكيل وحدات لكل ملليلتر. إضافة 130 ميكرولترات من الفيروس المخفف إلى كل بئر من الخلايا المصابة. تعيين بئر واحد من الخلايا غير المُصابة كتحكم سالب وإضافة نفس الكمية من الفيروسات.
احتضان الخلايا في 38.5 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام. في اليوم السابق للفرز إعداد اثنين من 96 لوحات جيدا عن طريق البذر 20،000 الخلايا في كل بئر. ثلاثة أيام بعد العدوى استرداد لوحات الآبار الستة التي تحتوي على CEF المصابة والمصاب بالعدوى.
تعرق المتوسطة من كل بئر وشطف ورقة الخلية مع برنامج تلفزيوني. إضافة ملليلتر واحد من 0.05٪ التربسين-EDTA إلى كل بئر واحتضان الخلايا في 38.5 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس دقائق تقريبا. ثم، resuspend الخلايا مع 50 ميكرولترات من FBS ونقل هذا التعليق إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 ملليلتر.
جهاز طرد مركزي في 200 مرة الجاذبية لمدة خمس دقائق. resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ FBS. استخدم مقياس الهيموسيتات لحساب الخلايا وضبط كثافة الخلايا إلى مليون خلية لكل ملليلتر.
بعد ذلك، نقل الخلايا إلى أنبوب فرز البوليسترين من خلال غطاء مصفاة لها. باستخدام فرز فرز الخلية الخلايا المفردة التي تعبر عن GFP في 96 جيدا لوحات preseededed. احتضان لوحات مع الخلايا مفروزة في 38.5 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمسة أيام.
بعد خمسة أيام استخدام المجهر fluorescence للتحقق من 96 لوحات الآبار ووضع علامة على الآبار التي تحتوي على لوحة إيجابية GFP واحد. Trypsinize كل GFP إيجابية بشكل جيد مع 50 ميكرولترات من التربسين-EDTA لمدة ثلاث دقائق. ثم، إضافة 50 ميكرولترات من الثقافة المتوسطة لإعادة تعليق الخلايا ونقل هذا التعليق إلى بئر واحدة من لوحة ستة بئر مع CEFs.
بعد ثلاثة أيام تجميد أسفل قارورة واحدة من كل من الجيل الأول من الفيروسات المؤتلفة في تجميد المتوسطة. تخزين هذه الفيروسات المحصودة في النيتروجين السائل. جمع 100000 خلية من كل من الجيل الأول من الفيروسات.
الطرد المركزي الخلايا في 2، 000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق، والتخلص من الفائق. تخزين الخلايا في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لإجراء استخراج الحمض النووي. عندما تكون على استعداد لأداء استخراج الحمض النووي استخدام 50 ميكرولترات من عازلة السحق لإذابة الجليد و resuspend الكريات الخلية.
Lyse العينات في 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم في 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين لإلغاء تنشيط البروتين K.Perform تفاعل PCR مع ثلاثة primes تقاطع رئيس باستخدام ميكرولتر واحد من كل عينة الحمض النووي كما هو مبين في بروتوكول النص. تحميل اثنين microliters من منتجات التضخيم إلى بئر واحد من 1٪ agarose هلام للكهربية هلام. لإزالة جين GFP من الفيروس المؤتلف، استخدم كاشف transfection لنقل اثنين من ميكرولترات التعبير Cre المؤتلف البلازميد في لوحة ستة بئر التي تم بزائد مع خلايا CEF.
12 ساعة بعد التفكّر في قارورة واحدة من الفيروس المؤتلف من النيتروجين السائل. بلطف resuspend الفيروس والبذور 50 microliters في كل بئر من الخلايا المصابة، ووضع واحد وكذلك السيطرة السلبية مع نفس الكمية من الفيروس. احتضان في 38.5 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام.
72 ساعة بعد العدوى إعداد الخلايا لفرز كما هو موضح سابقا. فرز الخلايا غير الفلورية واحدة في لوحة 96 جيدا بهيدر مع CEFs. بعد ذلك، قم بتخبير اللوحات المختارة وإعادة تعليق الخلايا المقابلة كما هو موضح في بروتوكول النص.
تمرير نصف الخلايا في كل بئر من 96 لوحة البئر التي تم بزهاء مع CEFs كجيل الثاني. جهاز طرد مركزي الخلايا المتبقية من كل استنساخ في 200 مرة الجاذبية لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وإعادة تعليق الخلايا مع 50 ميكرولترات من المخزن المؤقت السحق لاستخراج الحمض النووي.
ثم، تنفيذ PCR مع خمسة primers تقاطع رئيس باستخدام ميكرولتر واحد من قالب الحمض النووي كما هو مبين في بروتوكول النص. وبناء على نتائج PCR اختيار ثلاثة إلى خمسة استنساخ إيجابية من HVT المؤتلف لمزيد من الممرات والتحقق. أولاً، تصيب CEFs بالجيل الثاني من HVT المؤتلف في طبق 24 بئر.
48 ساعة بعد العدوى إزالة المتوسطة الثقافة وإضافة 500 ميكرولترات من 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني لإصلاح الخلايا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بإزالة التثبيت وغسل طبقة الخلية ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولترات من 0.1٪ تريتون X-100 ل Permeabilize الخلايا. بعد 15 دقيقة غسل طبقة الخلية ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة مخزن حظر مؤقت لمدة ساعة واحدة لحظر الربط غير المحدد.
ثم، تمييع الجسم المضاد الأساسي المضاد VP2 أحادية النسيلة الجسم HH7 أو مصل الدجاج المصاب HVT في واحد إلى 200 في عازلة سد. أضف 200 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية المخففة إلى كل بئر وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. غسل طبقة الخلية ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
تمييع الجسم المضاد الثانوي الماعز المضادة للماوس IgG اليكسا 568 أو الماعز المضادة للدجاج IgG اليكسا 488 في واحد إلى 200 في عازلة حظر. أضف 200 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية المخففة لكل بئر وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
استخدم مجهر الفلوريسنس للتحقق من تعبير البروتين. في اليوم السابق للفيروس توسيع البذور 2.6 مليون خلية CEF في كل قارورة T25. ذوبان ما لا يقل عن ثلاثة مستنسخين إيجابية وإضافة قارورة واحدة من الخلايا أو الفيروسات إلى كل قارورة.
احتضان القارورة في 38.5 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى لوحظ تأثير 50٪cytopathic. حصاد المقبل الخلايا في مليلتر اثنين من المتوسط الثقافة. تصيب 50 ميكروليتر إلى قارورة T25 جديدة تم بزغة مسبقة مع خلايا CEF للجيل القادم.
استمر في تمرير الفيروس المؤتلف لمدة 15 جيلًا على الأقل. باستخدام PCR تحليل كل جيل من الفيروسات لوجود تسلسل VP2. باستخدام مقايسة مناعية غير مباشرة تحليل كل جيل من الفيروسات التعبير VP2.
بعد فرز خلية واحدة يتم تحليل الفيروس المنقى التي تم الحصول عليها بواسطة ثلاثة رئيس تقاطع PCR، مما يدل على منتج PCR من الحجم المتوقع. بعد ختان مراسل GFP من قبل Cre إعادة الكومبينيز أكثر من 50٪ من اللويحات فقدت تعبيرهم GFP. يتم الحصول على البلاك المنقى بعد ختان GFP عن طريق فرز الخلايا المفردة ويتم تأكيده كذلك من قبل خمسة رئيس تقاطع PCR الذي يظهر المنتج من الحجم المتوقع.
ثم يتم تأكيد تعبير البروتين عن طريق فحص المناعة غير المباشرة مع VP2 الأجسام المضادة أحادية النسيلة محددة ومصل الدجاج المضادة HVT. كما هو متوقع، لا يمكن أن تلطخ الخلايا المصابة بفيروس HVT الوالدين إلا عن طريق مصل مضاد HVT. في حين أن الخلايا المصابة بفيروس HVT المؤتلف تظهر بوضوح التعبير عن جين VP2.
لإنشاء فيروس المؤتلف معدل عالية transfection مطلوب لتعظيم فرصة الفيروس وإدراج لتلبية في نفس الخلية لتحرير أن يحدث. بعد هذا الإجراء يمكن إجراء تجارب على الحيوانات لتقييم المناعة وفعالية اللقاحات المؤتلفة. إن تطوير لقاحات جديدة متعددة التكافؤ لناقلات الأمراض باستخدام منصة نظام CRISPR/Cas9 الموصوفة هنا سيكون مفيدًا للغاية لصناعة الدواجن للحماية من أمراض الدواجن المتعددة.
