Name: a simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels
Uploaded: 2018-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מכוני הבריאות הלאומיים (R01-NS084941), אריזונה הנציבות מחקר ביו-רפואי (ADHS16-162406) PTR. ווה קיבל בעבר תמיכה של פגישה מראש הדוקטורט נבחרת מוסדות של בריאות הכשרה למענק (T32-HL007249).

כל ההליכים המתוארים להלן אושרו על-ידי, טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש הוועדה (IACUC) ו לציית הלאומית המכונים לבריאות (NIH) ומחקר חיה: דיווח ב- Vivo ניסויים (יגיעו) הנחיות. הזרם פרוצדורליים עבור הפרוטוקול מתואר באיור1.
1. הגדרת תהליך
<ol><li>להכין מאגר microvessel המוח (BMB). התחל על ידי שקילה 54.66 g D-מניטול, 1.90 g EGTA ו- 1.46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (קרי, טריס) בסיס לתוך גביע נקי. להוסיף אני 1.0 ליטר מים יונים. לערבב את הרכיבים של המאגר BMB באמצעות של פגים. לאחר הפתרון היה מעורב באופן יסודי, להתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות 1.0 M HCl.</li>
	<li>להכין 26% לתוספי (MW 75,000) פתרון (w/v) לפני מאלחש חיות. הכינו את הפתרון לתוספי כפי שתואר בשלבים הבאים. הערה: חשוב באופן קריטי להכין פתרון זה מבעוד מועד כי לתוספי יכול לקחת כ- 1.5-2 h כדי להמיס במאגר מימית.<ol>
<li>שוקלים לצאת לתוספי אבקת (26 גרם לכל מאגר 100 מ ל) לתוך גביע נקי.</li>
		<li>למדוד את נפח מתאים של BMB, לוותר על תוך גביע נפרדים, נקי.</li>
		<li>שופכים לאט BMB לתוך כשהספל המכילה אבקת לתוספי. באופן ידני מערבבים את אבקת לתוספי בזמן מזיגת BMB באמצעות מוט מערבבים זכוכית.</li>
		<li>להתאים את ה-pH ל 7.4 עם HCl M 1.0 מיד מוקדמת לשימוש. הערה: בידוד טיפוסי של המוח microvessels מ 12 חולדות ספראג-Dawley בודדים (זכר או נקבה; בגיל 3 חודשים; 200-250 g) דורש 200 מ של פתרון לתוספי (קרי, לתוספי 52 g ב- 200 מ של BMB).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. מיצוי של רקמת המוח של חולדות ספראג-Dawley
<ol><li>בעקבות ניסיוני הטיפול הרצוי, עזים ומתנגד חולדות ספראג-Dawley באמצעות קטאמין (50 מ"ג/ק"ג; i.p. 2.5 mL/kg) וחריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/מ"ל; 2.5 מ"ל/ק"ג. אני, p.). לדלל קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים ב- saline 0.9% כדי ריכוז סופי של 20 מ"ג/מ"ל ו- 4.0 מ"ג/מ"ל בהתאמה. המתת חסד בעלי חיים ע י עריפת ראשו באמצעות גיליוטינה מחודדים בהתאם להנחיות IACUC. השתמש בפרוצדורה זהה עבור חולדות ספראג-Dawley גם זכר וגם נקבה.</li>
	<li>נכרות את העור מן הגולגולת חולדה על ידי ביצוע חתך רוחבי אחד באמצעות מספריים כירורגיים.</li>
	<li>באמצעות rongeurs, בזהירות הסר את לוחית הגולגולת וחושפים את המוח.</li>
	<li>מסירים את המוח בעזרת מרית. לנתק את המוח הגדול ולמקם על רקמת המוח מבודדים לתוך צינור חרוטי 50 מ ל המכיל 5 מ של BMB. הוסף μL 1.0 של מעכב פרוטאז קוקטייל לכל 1.0 מ"ל BMB מאגר מיד לפני השימוש.</li>
</ol>3. המוח עיבוד
<ol><li>העברה על רקמת המוח מהצינור חרוט 50 מ ל צלחת פטרי נקי.</li>
	<li>בעדינות באמצעות מלקחיים, לגלגל המוח על 12.5 ס מ קוטר מסנן נייר כדי להסיר את קרומי המוח החיצונית, אשר הם דבקו באופן רופף של קליפת המוח. בעדינות לחץ על רקמת המוח נגד נייר סינון וגלגלי הרקמה שוב. הפעל נייר הסינון לעתים קרובות במהלך שלב זה.</li>
	<li>להפריד מקלעת דמית העין בין האונות באמצעות מלקחיים. הערה: מקלעת דמית העין מופיע ברור עלי הלוואי קרומיים רקמה מקומי על פני השטח של החדרים מוחי.</li>
	<li>בעדינות לשטח על רקמת המוח ולהסיר הנותרים קרומי המוח, הריח נורות באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>למקם את רקמת מוח קליפתי מרגמה סיינג טאו. להוסיף mL 5.0 של BMB מעכב פרוטאז המכיל קוקטייל המליטה.</li>
	<li>שימוש מהמגן חשמל תקורה, homogenize על רקמת המוח באמצעות 15 לאורך קווים-3,700 סל ד. לבצע המגון באמצעות 10 מ"ל ומכתש רקמות מטחנה. בין המגון כל מדגם בודדים, נקה את שהעקב באמצעות אתנול 70%. הערה: המגון משיחות צריך להיות עקבי במונחים של קצב ובהיקף.</li>
	<li>שופכים את homogenate לתוך צנטריפוגה שכותרתו צינורות.</li>
</ol>4. צנטריפוגה צעדים
<ol><li>להוסיף 8.0 מ של 26% לתוספי פתרון כל שפופרת צנטריפוגה שכותרתו המכיל homogenate במוח.</li>
	<li>היפוך הצינור פעמיים ולאחר מכן ביסודיות מערבולת המדגם. לנהל את vortexing של כל דגימה באמצעות זוויות מרובים כדי להבטיח ערבוב יסודי של המוח פתרון homogenate 26% לתוספי פתרון....</li>
	<li>צנטריפוגה דגימות ב x 5,000 g למשך 15 דקות ב 4 º C. הערה: עבור כמה ניתוחים, זה שימושי להשוות בין המוח microvessels עם parenchyma המוח. צריך להיות להערכת ביטוי חלבון המוח parenchyma הנדרשים, תגובת שיקוע של שלב זה צנטריפוגה (קרי, המוח parenchymal שבר) יכול להיות נאספים ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע באמצעות ליניקת אבק, זכוכית פסטר פיפטה. הערה: זהירות יש לנקוט כדי לא להפריע בגדר. אחרת, כמות microvessels המוח שנאספו יקטן, אשר יקטין באופן משמעותי את התשואה חלבון של הליך זה.</li>
	<li>Resuspend בגדר ב mL 5.0 של BMB המכילה פרוטאז מעכב קוקטייל (קרי, 1.0 μL פרוטאז מעכב קוקטייל לכל 1.0 מ"ל BMB מאגר). מערבולת בגדר כדי להבטיח ערבוב יסודי.</li>
	<li>להוסיף 8.0 מ של 26% לתוספי כל שפופרת צנטריפוגה ו מערבולת כמתואר בצעדים 4.1-4.2 של פרוטוקול זה.</li>
	<li>צנטריפוגה דגימות ב x 5,000 g למשך 15 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>באמצעות תרמוס פיפטה מזכוכית, תשאף תגובת שיקוע ולהבטיח את גלולה המכילה microvessel המוח לא מופרת. הערה: חומר עודף יש דבקה הקיר צינור אינו מכיל microvessels, צריך להיות בזהירות מנקים את הסיר.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.5 עד 4.8 נוספים פעמיים.</li>
	<li>פעם צעדים צנטריפוגה לתוספי 4 הושלמו, להוסיף 5.0 מיליליטר BMB צניפה כל המערבולת כדי resuspend את הדגימה. הערה: לאחר השלמת שלב 4.10, microvessels כל ניתן לאסוף לניתוח של חלבון לוקליזציה. זה יכול להתבצע על-ידי לקיחת μL 50 aliquot של microvessel מחדש על תנאי צניפה מורחת על משטח זכוכית מיקרוסקופ. Microvessels הם ואז חום-קבוע ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על בלוק חימום ואחריו קיבוע באתנול קר כקרח עבור שקופיות נוספות 10 דקות ואז ניתן לאחסן ב 4 ° C עד הדרושים עבור הדמיה מחקרים.</li>
</ol>5. Ultracentrifugation להכין דגימות של ממברנות Microvascular מוחי מוחלט
<ol><li>העברת דגימות מהמגן סיינג טאו.</li>
	<li>שימוש מהמגן חשמל תקורה, homogenize רקמת המוח באמצעות 8-10 לאורך קווים ב-3000 סל ד. המגון מתנהל באמצעות 10 מ"ל ומכתש רקמות מטחנה. לנקות את שהעקב באמצעות אתנול 70% בעקבות המגון כל דגימה בודדת.</li>
	<li>העברת דגימות לנקות צינורות ultracentrifuge. מספר ולשקול כל שפופרת בודדים. איזון, זוג הצינורות לפני טעינה אל הרוטור ultracentrifuge. הערה: כל שקילה, זיווג של צינורות ultracentrifuge שחייבת להתנהל עם הפקקים כדי להבטיח מדידה מדויקת של שפופרת משקולות.</li>
	<li>צנטריפוגה דגימות ב x 150,000 g עבור h 1-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>באמצעות flask ואקום זכוכית פסטר פיפטה, תשאף תגובת שיקוע באמצעות טיפול לא להפריע בגדר ממברנה נימי.</li>
	<li>בהתבסס על גודל צניפה, להוסיף אמצעי אחסון המתאים מאגר אחסון, אשר מורכבת BMB ומים יונים על יחס 1:1 (v/v). בדרך כלל, כדורי הם resuspended ב 400-500 μL מאגר אחסון. להוסיף קוקטייל מעכב פרוטאז מאגר אחסון על יחס של 1.0 μL לכל 1.0 מ"ל של מאגר אחסון.</li>
	<li>מערבולת דגימות resuspend צנפה מאגר אחסון.</li>
	<li>באמצעות כוס פסטר פיפטה, העברת דגימות ממברנה נימי צינור microcentrifuge שכותרתו mL 1.5.</li>
	<li>מעבר מדגם באמצעות מחט מזרק 5 x כדי להבטיח המדגם באופן יסודי מעורב כי אין אגרגטים סלולרית קיימת.</li>
	<li>חנות דגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד הנדרש לצורך ניתוח. הערה: תכולת החלבון של כל מדגם ממברנה microvessel נמדד באמצעות שיטת ברדפורד.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals.">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).</li><li>Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Transporters+in+Central+Nervous+System+Drug+Delivery+and+Blood-Brain+Barrier+Protection:+Relevance+to+Treatment+of+Stroke.">Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke.</a> J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).</li><li>Ronaldson, P. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+transporters:+promoting+blood-brain+barrier+repair+in+response+to+oxidative+stress+injury.">Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury.</a> Brain Res. 1623, 39-52 (2015).</li><li>Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hypoxia-reoxygenation+on+rat+blood-brain+barrier+permeability+and+tight+junctional+protein+expression.">Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).</li><li>McCaffrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+oligomeric+assemblies+at+tight+junctions+of+the+blood-brain+barrier+are+altered+by+hypoxia+and+reoxygenation+stress.">Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress.</a> J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).</li><li>Lochhead, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+increases+blood-brain+barrier+permeability+and+induces+alterations+in+occludin+during+hypoxia-reoxygenation.">Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).</li><li>Lucke-Wold, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bryostatin-1+Restores+Blood+Brain+Barrier+Integrity+following+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury.">Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).</li><li>Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+inhibition+prevents+inflammatory+pain+induced+changes+in+the+blood-brain+barrier.">Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier.</a> Brain Res. , 6-13 (2008).</li><li>Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta+signaling+alters+substrate+permeability+and+tight+junction+protein+expression+at+the+blood-brain+barrier+during+inflammatory+pain.">Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).</li><li>Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+inflammatory+hyperalgesia+modulates+morphine+delivery+to+the+brain:+a+role+for+P-glycoprotein.">Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein.</a> J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).</li><li>Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+pain+signals+an+increase+in+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier.">Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier.</a> J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).</li><li>Pop, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+brain+injury+alters+the+blood-brain+barrier+phenotype+in+parallel+with+beta-amyloid+and+cognitive+changes+in+adulthood.">Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).</li><li>Thompson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+stress+signals+an+increase+in+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+(Oatp1a4)+at+the+blood-brain+barrier:+relevance+to+CNS+drug+delivery.">Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).</li><li>Tome, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-glycoprotein+traffics+from+the+nucleus+to+the+plasma+membrane+in+rat+brain+endothelium+during+inflammatory+pain.">P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).</li><li>Slosky, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetaminophen+modulates+P-glycoprotein+functional+expression+at+the+blood-brain+barrier+by+a+constitutive+androstane+receptor-dependent+mechanism.">Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism.</a> Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).</li><li>Artus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt/planar+cell+polarity+signaling+pathway+contributes+to+the+integrity+of+tight+junctions+in+brain+endothelial+cells.">The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+exposure+to+ethanol+downregulates+tight+junction+proteins+through+the+protein+kinase+Calpha+signaling+pathway+in+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells.">Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells.</a> Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).</li><li>Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-9+increases+the+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier+via+the+activin+receptor-like+kinase-1+receptor.">Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).</li><li>Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceramide+1-Phosphate+Increases+P-Glycoprotein+Transport+Activity+at+the+Blood-Brain+Barrier+via+Prostaglandin+E2+Signaling.">Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling.</a> Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).</li><li>Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexose+transport+and+phosphorylation+by+capillaries+isolated+from+rat+brain.">Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain.</a> Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).</li><li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy.">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).</li><li>McCaffrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junctions+contain+oligomeric+protein+assembly+critical+for+maintaining+blood-brain+barrier+integrity+in+vivo.">Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo.</a> J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).</li><li>Brzica, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+and+kidney+expression+of+sulfate+anion+transporter+sat-1+in+rats+exhibits+male-dominant+gender+differences.">The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences.</a> Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).</li><li>Ronaldson, P. T., Bendayan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+viral+envelope+glycoprotein+gp120+produces+oxidative+stress+and+regulates+the+functional+expression+of+multidrug+resistance+protein-1+(Mrp1)+in+glial+cells.">HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells.</a> J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).</li><li>Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+C-type+lectins-mediated+host-pathogen+interactions+with+dextran.">Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran.</a> J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).</li><li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier.">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li><li>Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Expression+of+P-glycoprotein+and+Organic+Anion+Transporting+Polypeptides+at+the+Blood-Brain+Barrier:+Understanding+Transport+Mechanisms+for+Improved+CNS+Drug+Delivery?.">Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?.</a> AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

במאמר זה מתוארת שיטה פשוטה ויעילה של הכנת דגימות חלבון ממברנה microvessels טרי מבודד מן החולדה רקמת המוח. דווח על מספר גישות עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels ו/או דור של ההכנות ממברנה מ microvasculature מבודדים21,22 20,13,ספרות , 24. פרוטוקול בידוד microvessel המתואר לעיל אמנם דומה עקרונית, גישה זו מוטבה כדי לאפשר הכנת ממברנה דגימות עם חלבון מעולה התשואה מחיה ניסיוני יחיד. הזה מראש חיסל את הצורך אל הבריכה microvessels לפחות שלושה עכברים ספראג-Dawley על מנת לקבל דגימות עם העשרה חלבונית משביע רצון לשימוש בגישות שונות לניתוח חלבון. גישות כאלה כוללים, אך אינם מוגבלים, תספיג ניתוח, שהכלים נקודה ו- co-immunoprecipitation. יצוין, כי הנוהג של איגוד microvessels של חיות ניסוי מרובים כדי ליצור דוגמה אחת מאוד מפחית את השתנות קבוצתיים. במידה זו, microvessel באגירת עלולה להביא נתונים עם התפשטות מופחתת שאינו מייצג השתנות נכון בביטוי חלבונים נצפתה בקרב אוכלוסיה של חיות ניסוי. מאז ניתן להכין דוגמאות חיות ניסוי יחיד, ההשתנות האמיתי של אוכלוסיה המחקר נלכד, מה שמאפשר עבור נתונים ניסיוני ואפשר להשיג זה עוד נציג של תהליך pathophysiological או תרופתי תחת בדיקה. יתרון נוסף הוא כי דגימות ממברנה microvessel ניתן להכין באמצעות מספר מופחת של חיות ניסוי.
אולי השיקול הכי קריטי בביצוע של פרוטוקול זה כרוך השלבים צנטריפוגה. אכן, צנטריפוגות יכולים להיות שונים בין מעבדות עקב שלהם גיל, יצרן, ו/או הכולל מצב תקינות. זה יכול להוביל וריאציות משמעותית רמת בפועל g (או רמת סל ד) ספין כדי ספין. בתפקיד זה וריאציה שלמות הדגימה ניתן למזער על ידי צנטריפוגה של כל הדגימות ב ניתוח השוואתי יחיד ביחד על הרוטור אותו באותו זמן. לדוגמה, אם הרוטור יש רק 12 חריצי זמינים עבור צינורות מדגם, ואז הבידוד והכנה של דגימות microvessel בניסוי בודדים תהיה מוגבלת לשתים עשרה. שיקול זה מבטיח כי הם דוגמאות מוכן המקבילות כי כל השתנות בביטוי חלבונים כלומר בין קבוצות הניסוי ניתן להקצות את תנאי הטיפול עצמו.
שיקול נוסף כרוך ההכנה של הפתרון לתוספי 26%, אשר נדרש עבור הפרדת microvessels מוח ורקמות parenchymal המוח באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. לתוספי הוא פולימר של גלוקוז עם שכיחות של היחידות α-1, 6-מקושרים, בדרך כלל בעל מבנה ליניארי של25. יש גם קיבולת מים גבוהה מחייב. לדוגמה, 1 גר' לתוספי 75 (קרי, לתוספי עם משקל מולקולרי מרושע של 75,000 דא הוא בשימוש ב פרוטוקול זה) שומר על 20-25 מ ל מים. זה רכוש של לתוספי יכול להוביל אתגרים עמוקה המסת האבקה לתוך המאגר מימית. מסיסות מימית יכולים להשתפר על ידי חימום הפתרון לתוספי טמפרטורה מרבית של 40 מעלות צלזיוס. על חימום, הפולימר אינטראקציה פחות עם מולקולות המים, ובכך לגרום לתוספי לאמץ קונפורמציה פחות המורחב (קרי, תואר נמוך יותר של החזקת מים) בתמיסה. חימום לטמפרטורות גבוהות יגרמו הפולימר לתוספי לשבור, לכן, זה יהיה לא אפקטיבי כמו ריאגנט הפרדת. בנוסף, זה חיוני כי ה-pH של התמיסה לתוספי ניתן לכוונן 7.4 מיד לפני השימוש. פתרונות של 26% לתוספי תוכלו לחוות pH משמעותי משמרות, אפילו מעל 1-2 שעות לאחר ההכנה. בשל שיקולים אלו, 26% לתוספי שהפתרון צריך להיות מוכן ביום של הניסוי, אבל עם מספיק זמן לפני ניתוקה של רקמת המוח כדי לאפשר פירוק והתאמה המתאימים של pH.
מגבלה של פרוטוקול זה כרוך הנוכחות של סוגי תאים אחרים של היחידה נוירו-וסקולריים (NVU) בהכנות microvessel. בנוסף תאי אנדותל, מורכבת NVU מרכיבי התא השונים כולל תאי גליה (קרי, האסטרוציטים, מיקרוגלייה), pericytes של הנוירונים 3,26,27. בידוד של microvessels מהמוח מכרסמים בדרך כלל מראה העשרה עם תאי אנדותל כלי הדם; עם זאת, ביטוי של חלבונים סמן עצביים, כמו גם ביטוי של גליה fibrillary חומצי החלבון (GFAP), סמן אסטרוציט הוקמה, הוא גם ציין. בנוסף, pericytes נמצאים בהכנות לדוגמה עקב שיוכן אינטימי אנדותל כלי הדם. בזמן הנוכחי, זה כמעט בלתי אפשרי לבודד את המוח microvessels של חיות ניסוי ולחסל כל pericytes נוירונים, האסטרוציטים. עם זאת, פרוטוקול זה כבר מתקדמים באמצעות צנטריפוגה מרובי שלבים כך הדגימות מועשר בתאי האנדותל (קרי, כפי שמצוין על-ידי ביטוי משופרת של PECAM-1 לאחר כל שלב צנטריפוגה) עם נוכחות מוגבלת של אחרים (סוגי תא קרי, כמצוין על-ידי מופחתת ביטוי של סמן עצביים חלבון synaptophysin-1 לאחר כל שלב צנטריפוגה).
באופן כללי, גישה זו עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels, הכנת דוגמאות קרום ניתן להתאים במעבדה כל עניין בלימוד BBB חלבונים בתנאים pathophysiological או תרופתי. לדוגמה, פרוטוקול זה מספק דוגמאות microvessel זה יכול להיות מנוצל עבור חקר חלבונים תחבורה סמים endogenously באים לידי ביטוי ב-2,BBB18. החוסן של גישה זו אפשרה את ההתבוננות דיסקרטית לשינויים Oatp1a4 בתגובה לגירויים תרופתי, נתונים ניסיוני הודיע עיצוב קפדני מחקרים להערכת הפונקציה טרנספורטר ורגולציה -BBB. הפרוטוקול המתואר לעיל ניתן גם להחיל על חלבון ניתוחים של צומת חזק חלבונים וחלבונים צומת adherens במאמץ להבין BBB בתנאים פיזיולוגיים וכדי ללמוד שינויים ב- BBB שלמות בתגובה pathophysiological לחצים תרופתי. בבירור, פרוטוקול זה ניתן להתאים ליישומים מרובים בשדה BBB ו, לכן, מייצג שיטה פשוטה אך חזקים, לשחזור כי ניתן לשלב לימודי BBB הדורשים אנליזת חלבונים.

מחסום הדם - מוח (BBB) קיים ממשק בין מערכת העצבים המרכזית (CNS) את מחזור מערכתי ואת ממלא תפקיד חיוני שמירה על הומאוסטזיס המוח. באופן ספציפי, BBB הפונקציות בדיוק שליטה ממס ריכוזי נוזל חוץ-תאי המוח, לספק ביעילות המזינים הללו הנדרשים על ידי רקמת המוח כדי למלא את דרישות המטבולית ניכר של ה-CNS1. תפקידים אלה לרמוז כי BBB, אשר קיים בעיקר ברמה של תא אנדותל microvascular, צריך להחזיק דיסקרטית מנגנונים המאפשרים כמה חומרים לגשת parenchyma המוח תוך הבטחת ואינטראקציות מזיקים לא יכול לצבור. אכן, תאי אנדותל microvascular המוח אינם fenestrated, התערוכה פינוציטוזה מוגבלת, אשר מבטיחים מחסור של חדירות לא בררניים2. בנוסף, תאי אנדותל של המוח microvessel אקספרס צמוד לצומת, adherens צומת חלבונים לפעול טופס בדיקה גופנית "לאטום" בין תאי אנדותל סמוכים ולהגביל במידה רבה paracellular דיפוזיה של חומרים נישא בדם לתוך המוח parenchyma. אכן, חדירות סלקטיבית של חומרים אנדוגניים ו אקסוגני מחייב ביטוי פונקציונאלי של ספיגת ו בזרימת מובילי3. צמתי הכללית, חזק, צמתי adherens, מסועי לעבוד ביחד כדי לשמור על המאפיינים מכשול ייחודי של BBB.
BBB היא מכשול דינאמי מגיב לגירויים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological, תרופתי. לדוגמה, היפוקסיה/reoxygenation מתח הוכח לווסת ביטוי של חלבונים צומת קריטית חזק (קרי, occludin, zonulae occluden-1 (זואי-1)), אשר מזוהה עם חדירות מוגברת paracellular אל כלי דם סמנים כזה כמו סוכרוז4,5,6. תצפיות דומות שנעשו ב- BBB בסביבה של פגיעה מוחית טראומטית7 ו-8,כאבים דלקתיים היקפיים9. אלה אותן מחלות יכול גם לווסת את מנגנוני הובלה ב BBB10,11,12,13,14. אכן, היפוקסיה/reoxygenation פגיעה מגבירה ביטוי פונקציונאלי אורגני אניון. מעביר מפוליפפטיד 1a4 (Oatp1a4) ב- BBB, אשר יכול להוביל עליות משמעותיות התעבורה דם-כדי-מוח של סובסטרטים תחבורה Oatp ספציפיים כגון taurocholate ו atorvastatin13. מאפייני BBB יכול להשתנות גם ע י pharmacotherapy עצמו, מנגנון זה יכול ליצור בסיס עבור שני שינויים עמוקים של אפקטיביות התרופה במוח, סמים-תרופתיות. לדוגמה, פרצטמול מטרות קולטן גרעיני מנגנוני איתות ב microvascular אנדותל תאי המוח, מגביר ביטוי פונקציונאלי של המשגר בזרימת קריטי P-גליקופרוטאין (P-gp), ומשנה תלויי-זמן שיכוך כאבים שהוענקו מורפיום, כאבים אופיואידים סמים ו P-gp הוקמה תחבורה המצע15. הבנה מעמיקה של שינויים BBB, יכולה להיגרם על ידי מחלות או סמים, דורש גם זיהוי ואפיון של מנגנוני הרגולציה ספציפי לשלוט לבצע שינויים אלה. אכן, דיסקרטית איתות המסלולים זוהו תאי אנדותל microvascular המוח לשלוט הביטוי מולקולרית של צומת חזק חלבונים16,17 ו מובילי15, 18,19. יחדיו, תצפיות אלה מציינים מורכבים מסלולים מולקולריים המעורבים ברגולציה של צמתי צר BBB, מסועי על בריאות ומחלה.
אתגר משמעותי במחקר של BBB היא הדרישה המוחלטת של שיטה פשוטה ויעילה עבור בידוד של microvessels של רקמת המוח נגזר חיות ניסוי והכנה עוקבות של דגימות ממברנה. דגימות אלה חייבים להיות מוכנים כך הם גם מועשר בתאי האנדותל microvascular המוח, מוגבל בנוכחות של סוגי תאים אחרים. במהלך השנים האחרונות, מתודולוגיות מרובים עבור בידוד של microvasculature מהמוח מכרסמים דווחו21,2220,13,הספרות המדעית. מאמר זה מתאר פשוט, חזקה, בעלת שיטה לשחזור עבור בידוד של microvessels מהמוח עכברוש, הכנת דוגמאות מועשרת ממברנה אנדותל שיכול לשמש לניתוח של ביטוי חלבון. יתרון של הפרוטוקול בידוד microvessel היא היכולת להשיג תכשירים לדוגמה באיכות גבוהה ועם תשואה מספיק חלבון של חיה ניסיוני בודדים. פעולה זו מאפשרת השיקול ההשתנות הבין-בעלי חיים בביטוי חלבונים. כזה מקדמה של פרוטוקול זה השתפרה במידה החוסן של BBB מחקרים כי הערכת יתר (או תת הערכה) על המשמעות האמיתית של חלבון שינויים ב- BBB עכשיו ניתן להימנע. בנוסף, הכללת מספר השלבים צנטריפוגה עם לתוספי מאפשר העשרת משופרת של microvessels בדגימות ניסיוני תוך עידוד הסרה של המרכיבים הסלולר לא רצויות כגון נוירונים.

<table><tbody><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8340</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M4125</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#E3889</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T1503</td><td>Component of brain microvessel buffer</td></tr><tr><td>Dextran (MW 75,000)</td><td>Spectrum Chemical Mftg Corp</td><td>#DE125</td><td>Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma</td></tr><tr><td>Zetamine</td><td>MWI Animal Health</td><td>#501072</td><td>General anesthetic</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Western Medical Supply</td><td>#5530</td><td>General anesthetic</td></tr><tr><td>0.9% saline solution</td><td>Western Medical Supply</td><td>N/A</td><td>General anesthetic diluent</td></tr><tr><td>Filter Paper (12.5 cm diameter)</td><td>VWR</td><td>#28320-100</td><td>Used for removal of meninges from brain tissue</td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes</td><td>Sarstedt</td><td>#60.540.386</td><td>Disposable tubes used for dextran centrifugation steps</td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; Coomassie Plus (Bradford) Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23236</td><td>Measurement of protein concentration in membrane preparations</td></tr><tr><td>Wheaton Overhead Power Homogenizer</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#903475</td><td>Required for homogenization of samples</td></tr><tr><td>10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#358039</td><td>Required for homogenization of samples</td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#H1758</td><td>Required for pH adjustment of buffers</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23210</td><td>Protein standard for Bradford Assay</td></tr><tr><td>Standard Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>#91100-12</td><td>Used for dissection of brain tissue</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>#16020-14</td><td>Used for opening skull to isolate brain</td></tr><tr><td>50 ml conical centrifuge tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#352070</td><td>Used for collection of brain tissue following isolation</td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipets</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#13-678-20C</td><td>Used for aspiration of cellular debris following dextran spins</td></tr><tr><td>Ethanol, anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#459836</td><td>Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman-Coulter</td><td>#41121703</td><td>Used for ultracentrifugation of samples</td></tr></tbody></table>

a simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels

מחסום הדם - מוח (BBB) היא רקמה מכשול דינמי המגיבה לגירויים שונים הקשורים pathophysiological ולא תרופתי. שינויים כאלה הנובעות גירוי יכול במידה רבה לווסת את משלוח סמים למוח ולגרום, לפי סיומת, אתגרים ניכרים בטיפול של מערכת העצבים המרכזית (CNS) מחלות. שינויים BBB רבים המשפיעים על pharmacotherapy, לערב חלבונים לשפות אחרות, בא לידי ביטוי ברמה של תאי אנדותל. אכן, ידיעה על BBB הפיזיולוגיה על בריאות ומחלה עוררה עניין רב במחקר של חלבונים אלה ממברנה. מבחינת מחקר מדע בסיסי, זה מרמז על דרישה עבור שיטה פשוטה אך חזקים לשחזור עבור בידוד של microvessels של רקמת המוח שנקטפו חיות ניסוי. לשם הכנת ממברנה דגימות microvessels טרי מבודד, זה חיוני כי ההכנות המדגם להיות מועשר בתאי האנדותל אבל מוגבלת בנוכחות סוגי תאים אחרים של היחידה נוירו-וסקולריים (קרי, האסטרוציטים מיקרוגלייה, הנוירונים, pericytes). יתרון נוסף הוא היכולת להכין דגימות מבעלי חיים בודדים על מנת ללכוד את ההשתנות נכון של חלבונים ביטוי אוכלוסיה ניסיוני. כתב יד זה, ניתנים פרטים בנוגע שיטה כי הוא מנוצל עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels והכנת דוגמאות ממברנה. Microvessel העשרה, מדגימות נגזר, מושגת באמצעות ארבעה שלבים צנטריפוגה איפה לתוספי נכלל במאגר של הדגימה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות על ידי מעבדות אחרות עבור יישומים ספציפיים משלהם. דוגמאות שנוצר מתוך פרוטוקול זה הוכחו תשואות נתונים ניסיוני של ניסויים ניתוח חלבון זה יכול לסייע מאוד את ההבנה של BBB תגובות לגירויים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological, תרופתי.

הזרם ניסיוני עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels, הכנת דוגמאות ממברנה microvessel מוצג באיור1. באמצעות ההליך המובאת כאן, בידוד מוצלחת של microvessels ללא פגע מן מוח עכברוש הוא הפגין (איור 2 א). כלים אלה התקבלו לאחר סיום צנטריפוגה עם לתוספי, מיד לפני התחלת ultracentrifugation להכין דגימות ממברנה (קרי, לאחר סיום שלב 4.10). בתמונה זו, microvessel זה ישאר באמצעות נוגדן נגד Oatp1a4, נהג זה הוכח לבוא לידי ביטוי גם ב קרום הפלזמה של המוח תאי אנדותל microvascular2,11,13, 18. באמצעות ניתוח תספיג (איור 2B), קרום גלמי microvessels שנקטפו חולדות נקבות ספראג-Dawley הוצגו להיות מועשר טסיות תא אנדותל אדהזיה מולקולה-1 (PECAM-1; ידוע גם בשם CD31), חלבון סמן עבור microvasculature במוח. PECAM-1 הוא מעכבות שיתוף קולטן מעורב תא T ו- B-cell איתות מתבטאת מאוד על קרום הפלזמה של תאי אנדותל כלי הדם. במהלך המיטוב של פרוטוקול זה, העשרה PECAM נצפתה בדגימות ממברנה המוכנים לשניים עד ארבעה צעדים צנטריפוגה לתוספי. כפי שמוצג באיור 2B, לא היה הבדל בביטוי PECAM בין דגימות שהוכנו באמצעות השלבים צנטריפוגה שונים; עם זאת, ארבע מהדורות לתוספי הביא בביטוי משופרת של תחבורה אנדותל חלבונים, אשר מציין microvessel משופר העשרה הדגימות. בנוסף, השימוש dextrans ארבע ספינים להסרת משופרת של המרכיבים הסלולר לא רצויים כמצוין על-ידי ביטוי מופחתת של חלבונים סמן עצביים כגון synaptophysin18. לכן, כל ההכנות עוקבות עבור המוח microvessel ממברנות בוצעו באמצעות ארבעה שלבים צנטריפוגה לתוספי. בניסויים שלנו תספיג ', שימש את טובולין חלבונים המרכיבים אותה microtubule פקד הטעינה. כפי שיקבע את שיטת ברדפורד, ממברנה ההכנות תשואה בדרך כלל ריכוז חלבון הנע בין 5.0 מ"ג/מ"ל 10.0 מ"ג/מ"ל. חלבון נציג כמת תוצאות מתוארים בטבלה1. ערכי חלבון אלה היו נחושים בהתבסס על עיקול רגיל שנוצר באמצעות אלבומין שור (BSA; 2.0 mg/mL) כסטנדרט (איור 3). דגימות חלבון היו מדולל 10-fold ב ברדפורד וזמינותו.
בעקבות חלבון כמת, דגימות ממברנה microvessel יכול להיות מנוצל עבור הביוכימי מתודולוגיות לניתוח חלבון כגון ניתוח תספיג, שהכלים נקודה או co-immunoprecipitation. איור 4A מתאר תספיג נציג עבור ה BBB תחבורה חלבון גלוקוז טרנספורטר-1 (היצף-1) שבו נותחו דגימות טבלה 1 . נקה להקות יחיד במשקל מולקולרי המתאים (קרי, חזה כדי להיות 54 kDa) עבור BBB זו באה לידי ביטוי מאוד חלבון התגלו בכל מדגם ממברנה. כל ליין בודדים בתספיג חלבון זה מייצג microvessel ממברנה מדגם שהוכן מחיה ניסיוני יחיד. חלבון שווה כל ליין נקבע באמצעות ATPase נתרן-אשלגן (קרי, Na+/K+ ATPase; החזוי משקל מולקולרי = 113 kDa) כפקד טעינה. כפי שמוצג באיור 4B, הרגש הגבוה ביותר של היצף-1 ב- BBB נצפתה אצל חולדות זכרים לעומת עמיתיהם הנשי. אין הבדל בביטוי של Na+/K+ ATPase נצפתה בין חיות זכר ונקבה. לניתוח זה densitometric, להקות היו quantitated באמצעות תוכנת ImageJ.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57698/57698fig1.jpg"> איור 1: חלוקה של הליכים ופרוטוקולים כדי לבודד עכברוש המוח microvessels וכדי להכין דגימות ממברנה. <a href="/files/ftp_upload/57698/57698fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57698/57698fig2.jpg"> איור 2: נציג נתונים מציג microvessel ללא פגע וביטוי של חלבון סמן תא אנדותל כלי הדם. ת: Immunofluorescence מכתים הראה לוקליזציה של Oatp1a4, נהג זה הוכח לבוא לידי ביטוי גם ב- BBB, ב- microvessel המוח ללא פגע מבודד כפי שמתואר פרוטוקול זה. Oatp1a4 לוקליזציה זוהה באמצעות נוגדן polyclonal של הארנב ספציפי נגד Oatp1a4 לדילול של 1:10. הנוגדן המשני היה פלורסנט מצומדת ארנב אנטי איג בשעה לדילול 1:300. סרגל קנה מידה = 7.5 μm. ב': ניתוח תספיג הפגינו את הטוהר של דגימות microvessel על-ידי הצגת העשרה של החלבון הסמן תא אנדותל ספציפי PECAM-1, אשר זוהה באמצעות נוגדן חד שבטי העכבר לדילול מטריים. הנוגדן המשני היה העכבר אנטי איג-לדילול 1:50, 000. BH = המוח homogenate, MV = microvessel גולמי שבר, MVM = ממברנות microvessel במוח. <a href="/files/ftp_upload/57698/57698fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57698/57698fig3.jpg"> איור 3: עיקול רגיל נציג עבור שיטת ברדפורד. אלבומין שור (BSA) שימשה כסטנדרט, היה מדולל על ריכוזי הבאים: 0 0.125, 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0 mg/mL. ספיגת נמדדה ב = 595 nm. כל נקודת נתונים מייצג ממוצע של שלוש קריאות ספיגת לפי ריכוז BSA. <a href="/files/ftp_upload/57698/57698fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57698/57698fig4.jpg"> איור 4 : תספיג נציג, מציג סקס הבדלים בביטוי היצף-1 קרום מוכן דגימות מן Microvessels המוח עכברוש מבודד. ת ניתוח תספיג מראה לביטוי היצף-1 בדגימות ממברנה המוכן microvessel מבודד חולדות ספראג-Dawley זכר ונקבה. היצף-1 זוהה באמצעות נוגדן חד שבטי ארנב לדילול שבערך. הנוגדן המשני היה IgG נגד הארנב monoclonal לדילול 1:40,000. נה=/K+ ATPase, סמן קרום פלזמה, הפקד הטעינה, זוהתה באמצעות IgG polyclonal של הארנב אנטי-דילולים 1: 40,000. ב': ניתוח densitometric של היצף-1 ביטוי בדגימות קרום מבודד חולדות ספראג-Dawley זכר ונקבה. תוצאות באים לידי ביטוי אומר SEM של חיות ניסוי 6 לכל קבוצה לטיפול. כוכביות מצביעים על נקודות נתונים הם משמעותיים מבחינה סטטיסטית של פקד. ערך של p <</c5> 0.05 נחשב להיות משמעותיים מבחינה סטטיסטית. <a href="/files/ftp_upload/57698/57698fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>חיה</td>
			<td>ספיגת ממוצע</td>
			<td>ספיגת מנוכי עונתיות</td>
			<td>ריכוז מחושב</td>
			<td>ריכוז בפועל</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>(Λ = 595 nm)</td>
			<td></td>
			<td>(mg/ml)</td>
			<td>(mg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 זכר</td>
			<td>0.7967</td>
			<td>0.3859</td>
			<td>0.768</td>
			<td>7.68</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 זכרים</td>
			<td>0.7849</td>
			<td>0.3741</td>
			<td>0.7417</td>
			<td>7.42</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 זכרים</td>
			<td>0.8187</td>
			<td>0.4079</td>
			<td>0.8173</td>
			<td>8.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 גברים</td>
			<td>0.7985</td>
			<td>0.3877</td>
			<td>0.7721</td>
			<td>7.72</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 זכר</td>
			<td>0.7943</td>
			<td>0.3835</td>
			<td>0.7628</td>
			<td>7.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 זכרים</td>
			<td>0.7251</td>
			<td>0.3143</td>
			<td>0.6084</td>
			<td>6.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 נקבה</td>
			<td>0.7114</td>
			<td>0.3006</td>
			<td>0.578</td>
			<td>5.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 הנשי</td>
			<td>0.7993</td>
			<td>0.3885</td>
			<td>0.7738</td>
			<td>7.74</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 נשים</td>
			<td>0.8201</td>
			<td>0.4093</td>
			<td>0.8203</td>
			<td>8.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 נשים</td>
			<td>0.7526</td>
			<td>0.3418</td>
			<td>0.6698</td>
			<td>6.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 הנשי</td>
			<td>0.8008</td>
			<td>0.39</td>
			<td>0.7773</td>
			<td>7.77</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 הנשי</td>
			<td>0.7975</td>
			<td>0.3867</td>
			<td>0.77</td>
			<td>7.7</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: נציג חלבון ריכוזים של המוח Microvessel ההכנות נגזר חולדות זכר ונקבה ספראג-Dawley. ספיגת מנוכי עונתיות ערכים נקבעים על-ידי חיסור רקע ספיגת-l = 595 nm מן הממוצע ספיגת ערכים עבור כל חיה ניסיוני. ב הזה assay, רקע ספיגת היה נחוש בדעתו להיות 0.4108.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels at JoVE.com

A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels

. הנה, מתוארת שיטה עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels, הכנת דוגמאות ממברנה. פרוטוקול זה יש יתרון ברור של הפקת microvessel מועשר דגימות עם חלבון מקובל תשואה של חיות בודדות. דוגמאות יכול לשמש לאחר מכן עבור ניתוחים חלבון חזקה על אנדותל microvascular המוח.

שיטה פשוטה לשחזור כדי להכין ממברנה דגימות מן החולדה טרי מבודד המוח Microvessels

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic barrier tissue that responds to various pathophysiological and pharmacological stimuli. Such changes resulting ...

a-simple-reproducible-method-to-prepare-membrane-samples-from-freshly

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K Views.  University of Arizona, Tucson. . הנה, מתוארת שיטה עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels, הכנת דוגמאות ממברנה. פרוטוקול זה יש יתרון ברור של הפקת microvessel מועשר דגימות עם חלבון מקובל תשואה של חיות בודדות. דוגמאות יכול לשמש לאחר מכן עבור ניתוחים חלבון חזקה על אנדותל microvascular המוח.

Video: A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Medicine

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

טיהור של כלי מוח עכבר

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

הכנת התינוק היילוד רקמת המוח עבור ניתוח בדיקת מבנית באולטרסאונד של הפצת שלפוחית סינפטית במסופי העצבים

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Biology

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

שיטת פלט גבוהה כדי לבודד קרום הלב של מוחין מהעכבר

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Endothelial Cell Culture from Rat Brain Microvessels: A Procedure to Isolate and Culture Endothelial Cells from Microvessels of Rat Brain

Source: Molino, Y. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/51278/setting-up-an-vitro-model-rat-blood-brain-barrier-bbb-focus-on-bbb">Setting-up an&#160;In Vitro&#160;Model of Rat Blood-Brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2014)
This video presents the isolation of microvessels from a rat brain using a combination of density gradient centrifugation and enzymatic digestion mehods. The isolated microvessels can be cultured in a culture flask pre-coated with collagen and fibronectin matrix to obtain endothelial cell colonies.

תרבית תאי אנדותל מכלי דם זעירים במוח חולדה: הליך לבידוד ותרבית תאי אנדותל מכלי דם זעירים במוח חולדה

Source: Molino, Y. et al. Setting-up an&#160;In Vitro&#160;Model of Rat Blood-Brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancer Research

Cancers of the Nervous System

In vitro studies

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free Media

Source: Collins, H. Y., et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/57122">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates a method for isolating and culturing microglia from rat brains. It entails separating microglia from other neuronal and non-neuronal cells using plates coated with a monoclonal antibody specific to microglia.

בידוד ותרבית של תאי מיקרוגליה ממוחות של חולדות באמצעות מדיה נטולת סרום

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Prepare a Petri Dish for CD11b ...

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Isolating Mouse Brain Vessels: A Protocol to Isolate Intact Vessels from Murine Brain Sample

Source: Boulay, A. C. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/53208" target="_blank">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the isolation of intact vessels from a mouse&#39;s brain that constitute the blood-brain barrier (BBB) along with neurons and glial cells. The isolated vessels can be used as an in vitro model to study their role in maintaining brain homeostasis.

בידוד כלי דם במוח של עכבר: פרוטוקול לבידוד כלי דם שלמים מדגימת מוח מורין

Source: Boulay, A. C. et al. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the isolation of intact vessels from a ...

In vivo studies

Obtaining a Single-Cell Suspension from Frozen Rat Brain Tissue

Source: Rubio, F. J., et. al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54358">Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the dissociation of frozen rat brain tissue into a single-cell suspension using enzymatic digestion and mechanical trituration. The prepared cells are fixed and permeabilized with ethanol for downstream applications like flow cytometry or gene expression analysis.

Source: Rubio, F. J., et. al. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat ...