Name: practical use of rna interference: oral delivery of double-stranded rna in liposome carriers for cockroaches
Uploaded: 2018-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מטייוואן (משרד המדע והטכנולוגיה, 100-2923-B-002-002-MY3 ביותר 106-2313-B-002-011-MY3 כדי H.J.L.), צ'כיה (גרנט אוניברסיטת סוכנות דרום בוהמיה, gaju ב להעניק 065/2017/P Y.H.L), ו (ספרד משרד הכלכלה הספרדית ואת התחרותיות, מעניקה CGL2012-36251 ו- CGL2015-64727-P X.B., הממשלה קטלאנית, להעניק 2014 SGR 619 X.B.); זה גם קיבלו תמיכה כספית מהקרן האירופאית כלכלי ולפיתוח אזורי (פדר כספים X.B.).

1. סינתזה והכנה של dsRNA
<ol><li>לזהות את האתרים היעד dsRNA באזור 3' לא מתורגם של גנים היעד. DsTub משמש עבור מיקוד הגן α-טובולין (באמבטיה) (מספר גישה GenBank: KX228233), dsEGFP כמו פקד dsRNA שלילי מתוכנן מרצף משופר פלורסצנטיות ירוק חלבון (EGFP; מספר גישה GenBank: LC311024).</li>
	<li>לבצע הגברה סטנדרטי PCR לסנתז את התבניות dsRNA עם גנים ספציפיים תחל המכיל את רצף יזם T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). ה-PCR הגברה תנאים ומידע פריימר להשתמש הם אלה דיווח מאת לין ואח. (2017) 12 (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להמשיך עם הכנה dsRNA באמצעות תיעוד T7 קיט (ראה טבלה של חומרים), ההוראות של היצרן. הערה: להניב כמות גבוהה dsRNA, לערבב שני בתגובות שפופרת אחת (ב µL 40 סה כ), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>להוסיף 2 µL של DNase (ראה טבלה של חומרים) לתוך dsRNA דגימות למשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לתבניות DNA תקציר.</li>
	<li>להוסיף 200 ריאגנט החילוץ µL (ראה טבלה של חומרים), 40 µL כלורופורם, ואז מערבולת.</li>
	<li>צנטריפוגה 10 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C, ואז לאסוף את תגובת שיקוע (150 µL) צינור microcentrifuge חדש.</li>
	<li>לזרז dsRNA ע י הוספת אלכוהול איזופרופיל µL 150 המקננת למשך 15 דקות על קרח.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 15 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>להוסיף 200 µL של האתנול 70% לשטוף dsRNA כדורי. צנטריפוגה 10 דקות ב 13,000 g x-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר האתנול, חזור על השלבים שטיפת אתנול.</li>
	<li>להסיר את אתנול וביו -גלולה dsRNA יבש על ידי ריכוז ואקום צנטריפוגלי למשך 3 דקות, ולאחר מכן resuspend dsRNA עם RNase ללא מים.</li>
	<li>לקבוע את כמות dsRNA מטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטרים UV-Vis של מיקרו-נפח (ראה טבלה של חומרים) לפי הוראות היצרן ולהתאים לריכוז הרצוי (לדוגמה, µg/µL 0.25 עבור הכנת dsRNA lipoplexes).</li>
	<li>אחסן את הדגימות dsRNA ב-20 ° C עד 3 חודשים.</li>
</ol>2. הכנת dsRNA Lipoplexes
<ol><li>µL 4 מהתרכובת תרביות תאים למהול (ראה טבלה של חומרים) על-ידי הוספת 4 µL של תמיסת גלוקוז 5%. לדלל 4 µL של dsRNA (1 µg) על-ידי הוספת 4 µL של תמיסת גלוקוז 5%.</li>
	<li>להוסיף את הפתרון ריאגנט ליפוזום מדולל מיד לתוך הפתרון מדולל dsRNA בבת אחת. מערבולת בקצרה כדי לערבב אותם, ואז תקופת דגירה של 15 דקות ב 25 º C. הערה: לא מערבבים את הפתרונות בסדר הפוך.</li>
	<li>Lipoplexes dsRNA מוכנים לשימוש. בתוך שעה של הכנה ושימוש למחוק לאחר 1 שעה. הערה: על פי הוראות היצרן, lipoplexes אמור לשמש בהקדם האפשרי.</li>
</ol>3. אוסף של אנזימים חוץ-תאית מ Hemolymph ומיץ פיתול
<ol><li>
מאגר מלוחים חרקים (מניות x 10)
	<ol>
<li>מערבבים את 900 מ"ל מים מזוקקים כפול עם 109.3 g NaCl, 15.7 גרם אשלגן כלורי, 6.3 g CaCl2ו- 8.3 g MgCl2·6H2O.</li>
		<li>להתאים את ה-pH את 6.8, ולמלא עד 1,000 מ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אוסף hemolymph
	<ol>
<li>עזים ומתנגד הג'וקים על הקרח עד שהם לא זזים במשך 3 דקות.</li>
		<li>החזק את הג'וק עם שתי אצבעות (באגודל ובאצבע) ולאחר תגביר את הצד הבטני של המקק.</li>
		<li>השתמש את המספריים ויבתר כדי לחתוך את הקצה של coxa של רגל אחורית. הערה: חותכים לצומת המחובר בין coxa לבין תל הירך. הכריתה של החלק השני של coxa היה פחות יעיל כדי לאסוף את hemolymph.</li>
		<li>לסחוט את הבטן בעדינות עם האצבע האמצעית, ולאסוף את hemolymph לדמם החתך עם micropipette 10 µL.</li>
		<li>מאגר של hemolymph של כמה ג'וקים (5 אנשים) צינור microcentrifuge. הערה: שמור את צינורות microcentrifuge על הקרח כדי למנוע melanization. נפח ממוצע של hemolymph המתקבל מקק זכר הוא 2-3 µL.</li>
		<li>ספין למטה hemolymph בקצרה עם צנטריפוגה benchtop 10 s.</li>
		<li>העברת לנפח הרצוי של hemolymph (כלומר, 10 µL), ערבב את זה עם µL 50 x 1 מאגר מלוחים חרקים.</li>
		<li>צנטריפוגה 10 דקות ב g x 1,000 ב 4 ° C עד שיהיו תוצאות hemocytes. להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי microcentrifuge.</li>
		<li>לכמת את ריכוז חלבון הכולל שימוש ספקטרופוטומטרים UV-Vis של מיקרו-נפח על ידי מדידת A28015.</li>
		<li>התאם כל מדגם יש ריכוז חלבון זהה (6 מ ג/µL של חלבון סה כ).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אוסף מיץ פיתול
	<ol>
<li>עזים ומתנגד הג'וקים על קרח. לשדך הג'וקים בצד הגחוני על הצלחת ניתוח קר 1 x מאגר מלוחים חרקים באמצעות סיכות חרקים.</li>
		<li>לנתח את הבטן עם פינצטה משובחים. הסר את הבטן כולה (כולל הבטן הקדמי, אמצע, האחוריות) כדי מאכל טריים עם 1 x מאגר מלוחים חרקים.</li>
		<li>להסיר את הבטן הקדמי ואת האחוריות, העבר במהירות את פיתול לרכבת התחתית microcentrifuge המכיל 100 µL מאגר מלוחים חרקים.</li>
		<li>מאגר של midguts של מקקים 6 באותו צינור ו מערבולת 10 s.</li>
		<li>צנטריפוגה 10 דקות ב g x 1,000 ב 4 ° C כדי לסובב את hemocytes ואת הבטן רקמות. להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי microcentrifuge.</li>
		<li>לכמת את ריכוז חלבון הכולל שימוש ספקטרופוטומטרים UV-Vis של מיקרו-נפח על ידי מדידת A28015.</li>
		<li>התאם כל מדגם יש ריכוז חלבון זהה (6 מ ג/µL של חלבון סה כ).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. dsRNA Assay השפלה
<ol><li>להכין טרי 4 µL של dsRNA עירום או dsRNA lipoplexes (1 µg).</li>
	<li>מערבבים מיץ dsRNA אנזימים פתרונות עם µL 10 מאגר מלוחים חרקים (בקרה), שחולצו מן hemolymph, או פיתול.</li>
	<li>להוסיף 2 µL של EGTA (20 מ מ) או מים נטולי RNase כדי להפריד בין דגימות כפקדי עבור עיכוב של אנזים פעילויות.</li>
	<li>תקופת דגירה של שעה אחת או יותר (6, 12 או 24 שעות) ב 25 º C.</li>
	<li>להוסיף 200 ריאגנט החילוץ µL ו- 40 µL כלורופורם, ואז מערבולת.</li>
	<li>צנטריפוגה 10 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C, ואז לאסוף את תגובת שיקוע (150 µL) צינור microcentrifuge חדש.</li>
	<li>לזרז dsRNA ע י הוספת אלכוהול איזופרופיל µL 150 המקננת למשך 15 דקות על קרח.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 15 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>להוסיף 200 µL של האתנול 70% לשטוף dsRNA כדורי. צנטריפוגה 10 דקות ב 13,000 g x-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר האתנול, חזור על השלבים שטיפת אתנול.</li>
	<li>להסיר את אתנול צניפה dsRNA יבש על ידי ריכוז ואקום צנטריפוגלי עבור 3 מינימלית dsRNA Resuspend עם מים ללא RNase µL 10.</li>
	<li>בדוק את תקינות dsRNA שטופלו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל על 1.5% agarose ג'ל.</li>
</ol>5. אוראלי מינהל dsRNA
<ol><li>לשמור על ג'וקים בדיאטה ad libitum של מזון יבש (מזון). לשלול אספקת מים המקקים יום אחד לפני dsRNA בליעה ניסויים.</li>
	<li>החזק מקק על ידי גרירה כנפיו עם המלקחיים גמיש (איור 1, שלב 5). הערה: לא אתפוס את חלקי הגופות של ג'וקים.</li>
	<li>להכין את dsRNA lipoplexes, וכן dsRNA עירום, האכלה, כמתואר בסעיף 2. הערה: Lipoplexes dsRNA צריך להיות מוכן טרי לפני האכלה.</li>
	<li>להאכיל µL 4 של dsRNA lipoplexes או dsRNA עירום (250 ng) עם micropipette.</li>
	<li>לאט לאט pipet ה-droplet של הפתרון dsRNA לסגור mouthparts של מקקים ולתת את הג'וקים להבלע ה-droplet לחלוטין.</li>
	<li>ביצוע הניסויים בליעה פעמיים ביום (h 1 לאחר אורות ו- h 1 לפני האורות) עבור 8 ימים או 16 ימים ברציפות. הערה: כל המקקים רכשה מים רק באמצעות האכלה ידנית עם dsRNA ריאגנטים פתרון או שליטה (למשלמים חינם נוקלאז, תמיסת גלוקוז, ריאגנט ליפוזום) במהלך הניסויים בליעה.</li>
	<li>לספק בקבוקי מים המקקים לאחר 16 ימי בליעה של dsRNA ניסויים.</li>
</ol>6. להעריך את נוקאאוט
<ol><li>בזמן שבחרת נקודות (2, 9, 17 ימים לאחר assay בליעה dsRNA), לאסוף את החרקים dsEGFP - או dsTub-מתייחסים ומנתחים הרקמות שבחרת (למשל, פיתול).</li>
	<li>לבצע PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR). לרביעיית-PCR הגברה התנאים והמידע תחל כפי שדווח על ידי לין ואח. (2017) 12.</li>
	<li>להעריך את הבקרה וחרקים שטופלו dsRNA מדי יום כדי לבדוק את התמותה ולהסיר את הג'וקים כי הם כבר לא נעים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicing+and+slicing:+The+core+machinery+of+the+RNA+interference+pathway.">Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway.</a> FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).</li><li>Bell&#233;s, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+drosophila:+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects.">Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).</li><li>Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J., Jeon, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+Five+-+Biological+Mechanisms+Determining+the+Success+of+RNA+Interference+in+Insects.">Chapter Five - Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 312, 139-167 (2014).</li><li>San Miguel, K., Scott, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next+generation+of+insecticides:+dsRNA+is+stable+as+a+foliar-applied+insecticide.">The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide.</a> Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).</li><li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi.">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).</li><li>Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+efficiency,+systemic+properties,+and+novel+delivery+methods+for+pest+insect+control:+What+we+know+so+far.">RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far.</a> Front. Physiol. 7, (2016).</li><li>Garbutt, J. S., Bell&#233;s, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success:+Evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica.">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).</li><li>Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+a+cDNA+encoding+extracellular+dsRNase+and+its+expression+in+the+silkworm,+Bombyx+mori.">Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNAi+efficacy+among+insect+species+is+attributable+to+dsRNA+degradation+in+vivo.">Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).</li><li>Wynant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+functional+characterization+and+phylogenetic+analysis+of+double+stranded+RNA+degrading+enzymes+present+in+the+gut+of+the+desert+locust,+Schistocerca+gregaria.">Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).</li><li>Huang, J. -. H., Belles, X., Lee, H. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+hypertrehalosemic+hormone+receptor+in+relation+to+hemolymph+trehalose+and+to+oxidative+stress+in+the+cockroach+Blattella+germanica.">Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica.</a> Exp. Endocrinol. 2, 114 (2012).</li><li>Lin, Y. -. H., Lee, C. -. M., Huang, J. -. H., Lee, H. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+regulation+of+permethrin+susceptibility+by+glutathione+S-transferase+(BgGSTD1)+in+the+German+cockroach+(Blattella+germanica).">Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica).</a> J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).</li><li>Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+taiman+in+insect+metamorphosis.">A role for taiman in insect metamorphosis.</a> PLOS Genet. 10, 1004769 (2014).</li><li>Lozano, J., Monta&#241;ez, R., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-2+family+regulates+insect+metamorphosis+by+controlling+the+juvenile+hormone+signaling+pathway.">MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).</li><li>Lin, Y. -. H., Huang, J. -. H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+delivery+of+dsRNA+lipoplexes+to+German+cockroach+protects+dsRNA+from+degradation+and+induces+RNAi+response.">Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response.</a> Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).</li><li>Gharavi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+cationic+polyamines+for+chiral+microcapsules+and+siRNA+delivery.">Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).</li><li>Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingested+double-stranded+RNAs+can+act+as+species-specific+insecticides.">Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+responses+of+migratory+locusts+to+systemic+RNA+interference+via+double-stranded+RNA+injection+and+feeding.">Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding.</a> Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).</li><li>Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+of+BmToll9-1+and+RNAi+machinery+genes+to+exogenous+dsRNA+in+the+midgut+of+Bombyx+mori.">Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori.</a> J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).</li><li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+for+mosquito+and+mosquito-borne+disease+control.">RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control.</a> Insects. 8, 4 (2017).</li><li>Taning, C. N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+RNAi+to+control+Drosophila+suzukii:+Laboratory+testing+against+larval+and+adult+stages.">Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages.</a> J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).</li><li>Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+systems+for+in+vivo+siRNA+delivery.">Lipidic systems for in vivo siRNA delivery.</a> AAPS J. 11, 639-652 (2009).</li><li>Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery.">Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).</li><li>Xia, Y., Tian, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+surface+properties+on+liposomal+siRNA+delivery.">Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery.</a> Biomaterials. 79, 56-68 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מציג שיטה עבור RNAi יעיל באמצעות משלוח אוראלי של dsRNA lipoplexes, הכוללת הגנה מפני עיכול ribonuclease במיץ פיתול המקק הגרמני. כפי שמוצג מחקרים אחרים במינים חרקים שונים, האפקט RNAi המסכן דרך משלוח אוראלי של dsRNA בעיקר מהצהוב מאת ההשפלה של dsRNA8,9,10. ...

RNAi הוכח בתור שיטה יעילה כדי ביטוי גנים תמונות ציפורים באמצעות מנגנון של שביל שתיקה post-transcriptional מופעלות על ידי מולקולות dsRNA פרוקריוטים רבים1. בעשור האחרון של המחקר, RNAi הפך להיות כלי שימושי כדי ללמוד את הפונקציות של גנים מפיתוח להתנהגות depleting הביטוי של גנים ספציפיים באמצעות הזרקת ו/או האכלה של dsRNA ב taxa שונים של חרקים2,3. בשל ירידה לפרטים החוסן של אפקט depleting, היישום של RNAi הוא להיות נחשב כיום כאסטרטגיה פוטנציאליים על המזיק בקרת ניהול4,5. עם זאת, היעילות של RNAi משתנה מאוד בין מיני חרקים, בהתאם של גנים שונים מהווים מטרה ואת שיטות משלוח. גוף גדל והולך של הראיות עולה כי חוסר היציבות של dsRNA, אשר נפגמים בשל ribonucleases, הוא גורם קריטי היעילות המוגבלת של RNAi5,6. למשל, הרגישות RNAi הנמוכה בסקסטה Manduca יש כבר מוסברת על ידי העובדה dsRNA מעורבב עם hemolymph היה מפורק במהירות בתוך שעה7. באופן דומה, הנוכחות של אלקליין nucleases ב פיתול, אשר ביעילות לבזות dsRNA בלע, הוא בחריפות מתואם עם יעילות נמוכה RNAi הזמנות חרקים שונים8,9,10.
מסירת dsRNA אוראלי הוא מעניין במיוחד עבור היישום של RNAi אסטרטגיה בקרת מזיקים, אבל שיטה מפגר ההשפלה של dsRNA מאת nucleases ב פיתול לא עדיין פותחה, אשר היה פוטנציאל כדי להבטיח אפקטיביות RNAi באמצעות האכלה. עם זאת, בעיית חוסר של RNAi כדי משלוח אוראלי של dsRNA דווחה על-ידי להאכיל כמות גדולה של dsRNA, למשל 50 µg, טוואי המשי, או האכלה ברציפות במשך 8 ימים (8 dsRNA µg סה כ) בהמין המדומה. המקק הגרמני, במיוחד germinica, היא רגישה מאוד RNAi על ידי ההזרקה של dsRNA11,12,13,14, אך לא מגיבים dsRNA באמצעות האכלה. לאחרונה, לין. et al. (2017) הדגימו כי dsRNA במארז עם תוצאות נושאות ליפוזום RNAi מוצלחת כדי נוקאאוט בביטוי הגן α-טובולין התמותה משמעותי פיתול והקו הדק של תיקן גרמני15. כמו ההשפלה של dsRNA בפיתול הגורם המגביל של RNAi אוראלי, נושאות ליפוזום לשמש רכב על dsRNA מפני השפלה, אשר זה רלוונטי ברצון ושאר חרקים עם פעילויות נוקלאז חזק בבטן. ראוי לציין, הסיבה לבחירת הכימית תרביות תאים מסוים (ראה טבלה של חומרים) היינו כמו מנשא ליפוזום בפרוטוקול הנוכחי הוא זה נבדק על תרביות תאים קו תא חרקים עם רעילות פחות, על פי הוראות היצרן. לפי ההשוואה של תרביות תאים ליפוזום שונים במערכות Gharavi. ואח (2013) 16, היעילות של RNA מפריעות קטן transfecting (siRNA) הוא כ זהה בין זה לבין מערכות אחרות זמינים מסחרית אשר שימשו dsRNA מערכות אספקה אחר חרקים17,18 . יתר על כן, שיטת האכלה שלנו הוא זהיר מספיק כדי להבטיח שהכמות הנכונה של dsRNA בליעתו על ידי כל מקק, כי התוצאות אינן מאושרות ועמיד. לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי לבין תוצאות מדגימים כי השימוש dsRNA lipoplexes משפר את יציבות dsRNA ופותח את הדלת בעיצוב של משלוח אוראלי האסטרטגיה של RNAi, אשר הינה גישה מבטיחה להדברה של עתיד.

<table><tbody><tr><td>GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent</td><td>SignaGen</td><td>SL100499</td><td>for lipoplexes preparation</td></tr><tr><td>Blend Taq plus</td><td>TOYOBO&amp;nbsp;</td><td>BTQ-201</td><td>for PCR</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>ABI&amp;nbsp;</td><td>4385612</td><td>for qPCR</td></tr><tr><td>FirstChoice RLM-RACE Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1700</td><td>for 3&#039; UTR identification&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>for dsRNA synthesis</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2239</td><td>remove DNA template from dsRNA</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>for dsRNA or total RNA extraction</td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>remove DNA template from total RNA&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>chloroform&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>for dsRNA or total RNA extraction</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td>for dsRNA or total RNA extraction</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24102</td><td>for dsRNA or total RNA extraction</td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>for RNase free water preparation</td></tr><tr><td>glucose solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3285</td><td>for lipoplexes preparation</td></tr><tr><td>Sodium chloride, NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>insect saline buffer formula</td></tr><tr><td>Potassium chloride, KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>insect saline buffer formula</td></tr><tr><td>Calcium chloride, CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>insect saline buffer formula</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>insect saline buffer formula</td></tr><tr><td>EGTA&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>enzyme inhibitor&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>dissecting scissor</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>cockroach dissection</td></tr><tr><td>fine tweezers</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>cockroach dissection</td></tr><tr><td>flexible tweezer</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>cockroach holding&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pipetman</td><td>RAININ</td><td>P10</td><td>sample preparation</td></tr><tr><td>microcentrifuge tube</td><td>Axygen</td><td>MCT175C, PCR02C</td><td>sample preparation</td></tr><tr><td>pipette tip&amp;nbsp;</td><td>Axygen</td><td></td><td>sample preparation</td></tr><tr><td>vortexter</td><td>Digisystem</td><td>vm1000</td><td>sample preparation</td></tr><tr><td>Minispin centrifuge</td><td>The Gruffin Group</td><td>GMC 206</td><td>for liquid spin down&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ALC</td><td>PK121R</td><td>sample preparation</td></tr><tr><td>pH meter&amp;nbsp;</td><td>JENCO</td><td>6071</td><td>for pH adjust</td></tr><tr><td>micro-volume spectrophotometer</td><td>Quawell</td><td>Q3000</td><td>nucleic acid quantitative</td></tr><tr><td>PCR Thermal cycler</td><td>ABI&amp;nbsp;</td><td>2720</td><td>for template PCR or&amp;nbsp; dsRNA synthesis incubation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>quantitative real-time PCR</td><td>ABI&amp;nbsp;</td><td>StepOne plus</td><td>gene expression quantitative</td></tr><tr><td>Centrifugal Vacuum Concentrators</td><td>eppendorf</td><td>5301</td><td>for dsRNA or total RNA extraction</td></tr><tr><td>Multipette&amp;nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>xstream</td><td>for real-time PCR sample loading&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose I</td><td>amresco</td><td>0710</td><td>for nucleic acid electrophoresis</td></tr><tr><td>tub gene specfifc forward preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA</td></tr><tr><td>tub gene specfifc reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA</td></tr><tr><td>dsTub template forward primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>dsTub template reverse primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>dsEGFP template forward preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG</td></tr><tr><td>dsEGFP template reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC</td></tr><tr><td>tub qPCR forward primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC</td></tr><tr><td>tub qPCR reverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC</td></tr><tr><td>ef1 qPCR forward primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A</td></tr><tr><td>ef1 qPCRreverse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCT GCA GAG GAA GAC GAA G</td></tr></tbody></table>

practical use of rna interference: oral delivery of double-stranded rna in liposome carriers for cockroaches

התערבות ב RNA (RNAi) הוחל באופן נרחב על חשיפת בפונקציות ביולוגיות של גנים רבים, יש כבר וליטוש של המזיק שליטה בכלי הפועלים על ידי הפרעה של ביטוי גנים חיוניים. למרות שיטות שונות, כגון זריקה, האכלה, ההשרייה דווחו על מסירה מוצלחת של זוגיות גדילי RNA (dsRNA), היעילות של RNAi דרך משלוח אוראלי של dsRNA זה משתנה מאוד בין קבוצות חרקים שונים. המקק הגרמני, במיוחד גרמנית, היא רגישה מאוד ההזרקה של dsRNA, כפי שמוצג על ידי מחקרים רבים שפורסמו בעבר. המחקר הנוכחי מתאר שיטה כדי להדגים כי dsRNA אנקפסולציה עם נשאים ליפוזום מספיקה מפגר ההשפלה של dsRNA מאת מיץ פיתול. ראוי לציין, ההזנה רציפה של dsRNA אנקפסולציה באמצעות ליפוזומים משמעותית מפחית את הביטוי טובולין, פיתול, והוביל למוות של מקקים. לסיכום, ניסוח וניצול מיטבי של dsRNA lipoplexes, אשר להגן dsRNA נגד nucleases, יכול להיות שימוש מעשי של RNAi הדברת חרקים בעתיד.

ערכה פשוטה של הפרוטוקול למסירה אוראלי של dsRNA מוצג באיור 1, שבו מוצגים השלבים המפתח עבור הכנת dsRNA lipoplexes.
על מנת לחקור את ההגנות המוקנות על ידי ליפוזום נושאות על השפלה dsRNA במיץ פיתול של גרמנית דרבוזמינותו של ex-vivo שבו ?...

Watch this Scientific Journal Video about Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches at JoVE.com

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

שימוש מעשי של RNA הפרעה: משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA ב ליפוזום ספקים עבור ג ' וקים

כתב יד זה מדגים דלדול של ביטוי גנים ב פיתול של המקק הגרמני באמצעות בליעה דרך הפה של זוגיות גדילי RNA במארז ליפוזומים.

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

practical-use-rna-interference-oral-delivery-double-stranded-rna

Research

JoVE Journal

Biology

9.3K Views.  National Taiwan University. כתב יד זה מדגים דלדול של ביטוי גנים ב פיתול של המקק הגרמני באמצעות בליעה דרך הפה של זוגיות גדילי RNA במארז ליפוזומים.

Video: Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ&quot;א סתר החיפושית,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Genetics

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran insects account for a number of economically substantial pests of plants that cause damage to crops by feeding on phloem sap. The brown marmorated stink bug (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) and the Asian citrus psyllid (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) are hemipteran insect pests introduced in North America, where they are an invasive agricultural pest of high-value specialty, row, and staple crops and citrus fruits, as well as a nuisance pest when they aggregate indoors. Insecticide resistance in many species has led to the development of alternate methods of pest management strategies. Double-stranded RNA (dsRNA)-mediated RNA interference (RNAi) is a gene silencing mechanism for functional genomic studies that has potential applications as a tool for the management of insect pests. Exogenously synthesized dsRNA or small interfering RNA (siRNA) can trigger highly efficient gene silencing through the degradation of endogenous RNA, which is homologous to that presented. Effective and environmental use of RNAi as molecular biopesticides for biocontrol of hemipteran insects requires the in vivo delivery of dsRNAs through feeding. Here we demonstrate methods for delivery of dsRNA to insects: loading of dsRNA into green beans by immersion, and absorbing of gene-specific dsRNA with oral delivery through ingestion. We have also outlined non-transgenic plant delivery approaches using foliar sprays, root drench, trunk injections as well as clay granules, all of which may be essential for sustained release of dsRNA. Efficient delivery by orally ingested dsRNA was confirmed as an effective dosage to induce a significant decrease in expression of targeted genes, such as juvenile hormone acid O-methyltransferase (JHAMT) and vitellogenin (Vg). These innovative methods represent strategies for delivery of dsRNA to use in crop protection and overcome environmental challenges for pest management.

This article demonstrates novel techniques developed for oral delivery of double-stranded RNA (dsRNA) through the vascular tissues of plants for RNA interference (RNAi) in phloem sap feeding insects.

שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Environment

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are delivered using a non-quantitative method. Accurate delivery of known quantities of nucleic acids or other chemicals is critical to measure the efficacy of the compound being tested and to allow reliable comparison between compounds.
Here we provide a reproducible, quantitative microinjection protocol that ensures accurate delivery of specific doses of dsRNA, reducing the mortality typically induced by injection injury. These modifications include the addition of Rhodamine B, a graduated injection needle, and an improved recovery method borrowed from Isoe and Collins. This method allows calculation of dose responses and facilitates comparisons between compounds. Versions of this method have been successfully used on three genera of mosquitoes as well as house flies to assess the reduction in fecundity resulting from gene silencing of ribosomal RNA transcripts.
This protocol provides strategies to reduce several challenges of small insect microinjection. Together, mechanical delivery of dsRNAs accompanied by visual verification, identification of effective locations for delivery, and inclusion of a post-injection recovery period ensure accurate dosing and low injury mortality. This protocol also describes an oviposition bioassay for uniform determination of effects on fecundity.

This protocol describes a microinjection methodology that we have standardized and used for several years to deliver specific quantities of nucleic acids directly to the hemolymph of mosquitoes and house flies. This protocol results in minimal injection mortality and allows dose correlated measurements of fecundity.

DsRNA לשחזור Microinjection, ההטלה Bioassay של יתושים וזבובים הבית

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

הפרעות RNA בחפשיות מימיות ככלי רב עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Applications of RNA Interference in American Cockroach

Cockroaches, a sanitary pest, are essential species in insect developmental and metamorphic studies due to their easy feeding and hemimetabolous characteristics. Altogether with well-annotated genome sequences, these advantages have made American cockroach, Periplaneta americana, an important hemimetabolous insect model. Limited by the shortage of knockout strategy, effective RNA interference (RNAi)-based gene knockdown becomes an indispensable technique in functional gene research of P. americana. The present protocol describes the RNAi operation techniques in P. americana. The protocol includes (1) selection of the P. americana at proper developmental stages, (2) preparation for the injection setting, (3) dsRNA injection, and (4) gene knockdown efficiency detection. RNAi is a powerful reverse genetic tool in P. americana. The majority of P. americana tissues are sensitive to extracellular dsRNA. Its simplicity allows researchers to quickly obtain dysfunctional phenotypes under one or multiple targeting dsRNA injections, enabling researchers to better use the P. americana for developmental and metamorphic studies.

The present protocol describes step-by-step guidelines for the RNAi operation techniques in P. americana.

יישומים של הפרעות RNA במקק אמריקאי

Cockroaches, a sanitary pest, are essential species in insect developmental and metamorphic studies due to their easy feeding and hemimetabolous ...

Developmental Biology

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects facilitated research in new facets of mosquito biology, including functional genetic studies in the primary African malaria vector Anopheles gambiae and the dengue and yellow fever vector Aedes aegypti. RNA interference- (RNAi-) mediated gene silencing has been used to target genes of interest in both of these disease vector mosquito species. Here, we describe a procedure for preparation of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are combined with food and ingested by larvae. This technically straightforward, high-throughput, and relatively inexpensive methodology, which is compatible with long double stranded RNA (dsRNA) or small interfering RNA (siRNA) molecules, has been used for the successful knockdown of a number of different genes in A. gambiae and A. aegypti larvae. Following larval feedings, knockdown, which is verified through qRT-PCR or in situ hybridization, can persist at least through the late pupal stage. This methodology may be applicable to a wide variety of mosquito and other insect species, including agricultural pests, as well as other non-model organisms. In addition to its utility in the research laboratory, in the future, chitosan, an inexpensive, non-toxic and biodegradable polymer, could potentially be utilized in the field.

Here we describe a procedure for inhibiting gene function in disease vector mosquitoes through the use of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are ingested by larvae.

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

<meta charset="utf8"></head><body>הזנת dsRNA בתיווך ננו-חלקיקים להשתקת גנים בזחלי תולעי משי

Larval RNA Interference in Silkworm Bombyx mori through Chitosan/dsRNA Nanoparticle Delivery

The silkworm, Bombyx mori, is an important economic insect with thousands of years of history in China. Meanwhile, the silkworm is the model insect of Lepidoptera with a good accumulation of basic research. It is also the first insect in Lepidoptera with its complete genome sequenced and assembled, which provides a solid foundation for gene functional study. Although RNA interference (RNAi) is widely used in reverse gene functional study, it is refractory in silkworms and other Lepidopteran species. Previous successful RNAi-related research to deliver double-stranded RNA (dsRNA) was performed through injection only. Delivery of dsRNA through feeding is never reported. In this article, we describe step-by-step procedures to prepare the chitosan/dsRNA nanoparticles, which are fed to the silkworm larvae by ingestion. The protocol includes (i) selection of the proper stage of silkworm larvae, (ii) synthesis of dsRNA, (iii) preparation of the chitosan/dsRNA nanoparticles, and (iv) feeding the silkworm larvae with chitosan/dsRNA nanoparticles. Representative results, including gene transcript confirmation and phenotype observation, are presented. dsRNA feeding is a simple technique for RNAi in silkworm larvae. Since silkworm larvae are easy to rear and large enough to operate, it provides a good model to demonstrate larval RNAi in insects. In addition, the simplicity of this technique stimulates more student involvement in research, making silkworm larvae an ideal genetic system for use in a classroom setting.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: קידום מחקר השתקת גנים בתולעי משי עם העברת dsRNA באמצעות הזנת ננו-חלקיקי צ'יטוזן

Presented here is a protocol for chitosan/dsRNA nanoparticle delivery in silkworm Bombyx mori larvae to induce gene silencing through ingestion.

התערבות RNA זחל בתולעי משי Bombyx mori באמצעות Chitosan/dsRNA אספקת ננו-חלקיקים

The silkworm, Bombyx mori, is an important economic insect with thousands of years of history in China. Meanwhile, the silkworm is the model insect of ...