עבודה זו נתמכה על ידי קרסט JST (גרנט מספר JPMJCR14W4), החברה עבור הקידום של המדע (JSPS) KAKENHI (גרנט מספר 25600060, 16K 16386), מרכז של חדשנות תוכנית MEXT, JST, התמקד בפיתוח טכנולוגיה הערכה מפתח מן הסוכנות היפנית מחקר רפואי ופיתוח, AMED, Mizuho קרן לקידום מדעי. מיקרו-מלאכותית נתמכה על ידי אוניברסיטת קיוטו ננו טכנולוגיה Hub.

1. ייצור התבנית Microfluidic התקן
<ol><li>עיצוב התבנית של המכשיר microfluidic באמצעות תוכנה זמינים מסחרית (Clewin5 או AutoCAD 2016, וכו.). עבור הפונקציה של Clewin5, עיין במדריך למשתמש (http://manualzz.com/doc/7159150/clewin-user-s-manual). הערה: הקובץ עיצוב זמין 1 קובץ משלים.</li>
	<li>להעביר את הקובץ עיצוב מחולל מיקרו דפוס וטען את הכלי עם מסיכה כרום מצופה של photoresist חיובי.</li>
	<li>לחשוף את photoresist חיובי באזור דפוס באמצעות גנרטור דפוס מיקרו.</li>
	<li>לפתח את photoresist חיובי באמצעות היזם (טבלה של חומרים), יש לשטוף את המסכה במים (DI) יונים.</li>
	<li>באמצעות etchant של כרום (טבלה של חומרים), לחרוט הכרומיום באזור החשוף שבו הוסר את photoresist חיובי. יש לשטוף את המסכה במים DI.</li>
	<li>הסר photoresist על המסכה באמצעות אצטון הנותרים. הערה: שקיפות מסיכה יכול להיות חלופה עבור המסכה Cr.</li>
	<li>להכין רקיק סיליקון נקי (4 אינץ, P(100)) וספין מעיל hexamethyldisilazane (HMDS) ב-3000 סל ד ל 30 s.</li>
	<li>HMDS Softbake למשך 5 דקות על 120 ° C וקריר כשהפחד למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>Spincoat photoresist שלילי (טבלה של חומרים) ב 500 סל ד עבור 10 s ו 1,200 סל ד ל 30 s. הערה: התנאי ציפוי ספין אמור להניב את השכבות photoresist עם עובי של 100 מיקרומטר על מוצרי קונדיטוריה לאחר פוטוליתוגרפיה.</li>
	<li>Prebake את photoresist שלילי 45 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, מגניב כשהפחד עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בדוק את עוצמת אור UV ניסוי, לחשב את זמן החשיפה מנה אנרגיה חשיפה סה כ- 250 mW/cm2. מניחים את photomask (שלב 1.1-1.6) על כשהפחד, לחשוף אותם לאור UV.</li>
	<li>Postbake photoresist שליליות עבור 1 דקות ב- 65 ° C ו- 5 דקות-95 מעלות צלזיוס. לאפשר את לחם הקודש להתקרר למשך 1 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לפתח את השכבה photoresist שלילית למשך 15 דקות באמבט מפתח (טבלה של חומרים) הראשון ו- 2 דקות באמבטיה השני. לשטוף את לחם הקודש באמבטיה אלכוהול איזופרופיל (IPA) הראשון 10 s ובאמבט IPA השני במשך 10 s.</li>
	<li>Hardbake photoresist שלילי במשך 30 דקות ב- 200 ° C וקריר כשהפחד למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>למדוד את עובי השכבה photoresist שלילי בעזרת פרופיילר משטח.</li>
	<li>הכנס את לחם הקודש desiccator מחובר משאבת ואקום ולהוסיף 200 µL של silane (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane). תדליק את המשאבה 10 דקות, ולאחר מכן כבה את זה ולשמור כשהפחד ב desiccator במשך 4 שעות.</li>
</ol>2. צעדים ייצור, ההרכבה של שכבות PDMS
<ol><li>הטלת הפולימר טרום polydimethylsiloxane (PDMS) (PDMS בסיס: אשפרה הסוכן = 10:1 (w/w)), דגה בתוך תא ואקום כבר שעתיים.</li>
	<li>התרופה PDMS ב 80 מעלות צלזיוס בתנור עם דש אוויר בין לילה.</li>
	<li>לקלף את PDMS מן כשהפחד סיליקון.</li>
	<li>אגרוף של 1A חורים - 3B (איור 1) ואת תרבות ספרואיד היטב. להשתמש אגרוף בקוטר 2-מ מ 1A חורים - 3B, בקוטר 1 מ מ אגרוף עבור ספרואיד טוב.</li>
	<li>לנקות המתים PDMS ואת תגית כיסוי זכוכית (24 מ"מ × 24 מ"מ) עם דבק, מאת שוב ושוב נדבקת, פילינג ביטול את הקלטת. אז תתייחס המתים PDMS עם אוויר פלזמה 40 s (40 mW, 50 sccm).</li>
	<li>בונד המתים PDMS על גבי בתגית כיסוי זכוכית לגרש את כל בועות האוויר מפני השטח בין המתים PDMS ואת מכסה התרופה ב 80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 12 שעות.</li>
</ol>3. ספרואיד הכנה
הערה: במחקר, חלבון פלואורסצנטי אדום לבטא את חבל הטבור האנושי הווריד תאי אנדותל (RFP-HUVECs) ולבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP-HUVECs) HUVECs משמשים ספרואיד, microchannels, בהתאמה, כדי להבחין את מקור HUVECs לאחר הקמת רשת כלי הדם perfusable. אם המקור של HUVECs לא נחוצה, ללא תווית HUVECs הן מספיק בשביל הניסוי.
<ol><li>להפשיר את RFP-HUVECs (3.0 × 105 תאים/מבחנה) ואת פיברובלסט אמבריולוגיה (hLF) (1.0 × 106 תאים/מבחנה) ולהוסיף אותם לתוך 10 מ"ל של מדיום עבור תאי אנדותל ותאים פיברובלסט, בהתאמה (טבלה של חומרים). תרבות אותם בקערה 100-מ מ- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 2-3 ימים עבור תת confluent RFP-HUVECs ו- hLFs. ההכנה הזאת תניב ~ 200 spheroids.</li>
	<li>לנתק את RFP-HUVECs ואת hLFs מתוך מבחר המאכלים עם 2 מ של 0.05% טריפסין-EDTA, לעצור את תגובת טריפסין עם 4 מ"ל DMEM המכיל 10% (v/v) העובר סרום שור (FBS) ו- 1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה ב g x 220 למשך 3 דקות, הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend את RFP-HUVECs ואת hLFs של המדיום אנדותל ריכוזי התא האחרון ב 2.5 × 104 ו- 1.0 × 105 תאים למ"ל, בהתאמה.</li>
	<li>להוסיף בעדינות µL 200 של התליה תא (5,000 תאים עבור RFP-HUVECs) ותאים 20,000 עבור hLFs לכל טוב בצלחת 96-ובכן עם משטח איגוד נמוך במיוחד.</li>
	<li>דגירה לצלחת 96-ובכן-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לתקופה של 2-4 ימים. הערה: מאז הקוטר ספרואיד תלוי תרבות תקופת ואת מספר הטלפון הראשונית בצלחת 96-ובכן, זה יכול להיות נשלט על ידי שני פרמטרים אלו.</li>
</ol>4. תא זריעה במכשיר Microfluidic
הערה: המוסכמה למתן את החורים, ערוצים, ספרואיד את טוב מודגמות באיור1. אנו מגדירים יום 0 היום לאחר קציר תאים לתוך המכשיר microfluidic יושלם. תיאור סכמטי של צירי הזמן ניסיוני מוצג באיור2.
<ol><li>טעינת ספרואיד יום − 1) הערה: בשלב הבא יש לבצעו על קרח כדי למנוע gelation של קולגן, פיברין.<ol>
<li>להמיס פיברינוגן בתוך buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עבור ריכוז סופי של 2.80 mg/mL.</li>
		<li>להכין ינוטרלו קולגן (3.0 מ"ג/מ"ל ב- PBS) על פי הפרוטוקול של היצרן.</li>
		<li>לשלב µL 107.2 בפתרון פיברינוגן (2.80 mg/mL), µL 8.0 ינוטרלו הקולגן (3.0 מ"ג/מ"ל) ו- 3.6 µL של aprotinin (5 U/mL) לכל תגובה בשפופרת. פתרון זה מתויג "הפתרון מיקס מאסטר" (MS). הערה: אמצעי האחסון נמצא מספיק עבור טעינת ספרואיד אחד. אם יש יותר מאחד ספרואיד, להכפיל כל אמצעי אחסון לפי מספר spheroids.</li>
		<li>להמיס תרומבין ב- PBS עבור ריכוז סופי של 50 U/mL. הערה: Aliquots של U/mL 50 תרומבין (20 µL tube) מאוחסנים −30 ° C, הם הקרת לפני ניסוי.</li>
		<li>מקם את הצלחת 96-ובכן המכיל את spheroids בתוך ארון אבטחה.</li>
		<li>להכין שתי צלחות פטרי 35 מ מ בפנים אבטחה, מארון עם צלחת אחת על קרח (תבשיל 1), המנה אחרים-benchtop (תבשיל 2). Pipet 99 µL של MS במרכז צלחת 1 (איור 3a) כדי ליצור droplet.</li>
		<li>לקצץ את הטיפים של 2 צהוב (10-100 µL) ונקה 3 טיפים פיפטה (1-100 µL) עבור האוסף של spheroids מהצלחת 96-ובכן, ערבוב תרומבין עם MS, אוסף מדויק spheroids, להזריק את spheroids לתוך המכשיר ולאחר הזרקת מדיה לתוך המכשיר , בהתאמה. גודל הנקבוביות של הקצה צריך להיות מעט גדול יותר מקוטר החורים 1A - 3B של ערוצים 1 ו- 3 או להתאים ספרואיד גם ערוץ 2 צמוד. הערה: בעתיד, אלא אם צוין אחרת, השתמש פיפטה בעצות לחתוך בשלב זה. הצילום של טיפים לחתוך זמין באיור4.</li>
		<li>לאסוף ספרואיד עם 100 µL בינוני מהצלחת 96-ובכן ולהוסיף אותו תבשיל 2 (איור 3 א).</li>
		<li>לאסוף את ספרואיד עם נפח מינימלי של מדיה מקערה 2. בעוד אתה מחזיק את pipettor זקוף, ספרואיד תנוע לכיוון התחתון של קצה pipet על ידי הכבידה. הוצא את ספרואיד על-ידי נגיעה בקצה pipet על גבי במניסקוס ה-droplet MS מנה 1 (איור 3 א). הערה: השלבים הבאים 4.1.10 & 4.1.11 צריכה להתבצע במהירות.</li>
		<li>מוסיפים 1 µL של תרומבין (50 U/mL) ומערבבים בעדינות עם קצה צהוב pipet.</li>
		<li>עם מוגדר 7 µL הפיפטה לאסוף את ספרואיד ומניחים לאט אותו לתוך הבאר ספרואיד (איור 3b).</li>
		<li>תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 ° C עבור gelation של פיברין.</li>
		<li>לאט לאט להחדיר האמצעי אנדותל חורים בערוצים 1A, 3A, מילוי 1 ו- 3 עם מדיה (20 ~ 30 µL/ערוץ).</li>
		<li>מניחים את המכשיר בצלחת 100-מ מ עם Kimwipe רטוב כדי למנוע אידוי של מדיה מהמכשיר (איור 3 c).</li>
		<li>מקם את המכשיר ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך 24 שעות ביממה להסיר את הבועות על הממשק בין המדיה לבין פיברין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יום 0) HUVECs טעינה<ol>
<li>הפשרת GFP-HUVECs (3.0 x 105 תאים/מבחנה) ולהוסיף אותם 10 מ"ל של המדיום אנדותל. תרבות אותם בקערה 100-מ מ- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 2-3 ימים להגיע sub-confluency. צלחת אחת של GFP confluent תת-HUVECs מספיקה להכנת 8-10 התקנים.</li>
		<li>ניתוק GFP-HUVECs מתוך מבחר המאכלים עם 2 מ של 0.05% טריפסין-EDTA ולהפסיק את תגובת טריפסין עם 4 מ"ל DMEM המכיל 10% (v/v) העובר סרום שור (FBS) ו- 1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין.</li>
		<li>לאחר צנטריפוגה ב g x 220 למשך 3 דקות, resuspend את ה-GFP-HUVECs במדיום אנדותל-5.0 x 106 תאים למ"ל.</li>
		<li>מזריקים HUVECs תא ההשעיה לתוך ערוץ 1 דרך החור 1B (µL לערוץ 20).</li>
		<li>להטות את המכשיר microfluidic 90°, להניח אותה על הצד, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להבטיח HUVECs לדבוק פיברין בערוץ 2.<ol>
<li>לאשר את הקובץ המצורף של HUVECs על פיברין. כאשר מספר HUVECs המחוברים הממשק בין ג'ל מדיום אינה מספיקה, להערכת עלול להתנתק בבסיס כלי הדם לאחר כמה ימים של המכשיר תרבות (איור 5). בפרוטוקול, שיעור ההצלחה זלוף הוא > 50%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>חזור על הצעדים 4.2.4 ו 4.2.5 ערוץ 3.</li>
		<li>התרבות תאים בצלחת 100-מ מ עם Kimwipe לחה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 7-14 ימים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יום 1 ~) החלפת המדיה<ol>
<li>להחליף חצי של אמצעי התקשורת בערוצים 1 ו- 3 כל יום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. הגרעינים מכתים
<ol><li>להכין 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS.</li>
	<li>הסר את המדיה בערוצים 1 ו- 3 ולהוסיף 20 µL של 4% מחברים לכל ערוץ. כדי להחליף את הפתרון ב 4% מחברים, אני חוזר הסרת הפתרון מהמכשיר והוספת 4% PFA שלוש פעמים.</li>
	<li>דגירה המכשיר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>להסיר 4% מחברים התקן, לשטוף הערוצים שלוש פעמים עם PBS.</li>
	<li>הוסף 20 µL של µg/mL 10 הפלורסנט (טבלה של חומרים) לערוץ כתם גרעינים הסלולר. כדי להחליף את הפתרון במכשיר, חזור על הסרת הפתרון מהמכשיר והוספת µg 10/mL של הפלורסנט שלוש פעמים.</li>
	<li>לאחסן את המכשיר ב 4 ° C עבור 24 שעות.</li>
</ol>6. נוזל זלוף של ספרואיד
<ol><li>הכינו את ספרואיד לאחר culturing יותר מ 7 ימים את ההתקן-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 להשלמת שביל דם רציפה.</li>
	<li>הסר את המדיום חורים 1A, 1B, 3A ו- 3B.</li>
	<li>להציג את µL 10 של 10 מיקרומטר פתרון של fluorescein isothiocyanate (FITC)-לתוספי ב- PBS לתוך חורים 1A ו- 1B.</li>
	<li>נטר את הזרימה של גרגרי או צבע FITC תחת מיקרוסקופ הפוכה.</li>
</ol>7. כימות של אורך נבט
הערה: התוכנה ver. 1.49 ImageJ משמש עבור כל ניתוח של התמונה במחקר זה.
<ol><li>חופפים תמונות מהימים GFP-HUVECs 0, 1, 3, 5 ו- 7.</li>
	<li>להחסיר את המיקום של הקצה להערכת של יום 0 מאותו מיקום על התמונות שצולמו בימים 1, 3, 5 ו-7.</li>
	<li>לקבוע את הצמיחה של קצה וסקולרית מהמיקום שורש (איור 6). המרחק בין קצה כלי הדם לבין השורש הוגדרה כמו אורך נבט במחקר זה (איור 7 ב).</li>
</ol>8. כימות של זוויות כלי דם
הערה: זווית וסקולרית הוגדרה כמו הזווית הורכב על ידי כלי הדם זווית, שורש, מרכז ספרואיד (איור 7c).
<ol><li>Binarize את הדימויים ספרואיד coculture המכיל RFP-HUVECs פלורסנט ולמדוד את העמדה "centroid" על ידי ניתוח פונקציה ב- ImageJ. במחקר זה, המיקום נמדד "centroid" מוגדר במרכז ספרואיד (איור 6).</li>
	<li>לקבוע את המיקום של עצות כלי הדם ואת השורשים באותו אופן בשלב 7.</li>
	<li>למדוד את הזוויות כלי הדם באמצעות ניתוח פונקציית בתוכנה ImageJ.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+Biology's+new+dimension.">Cell culture: Biology's new dimension.</a> Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+polarity+and+functional+bile+canaliculi+in+rat+hepatocyte+spheroids.">Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids.</a> Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).</li><li>Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organizing+principle:+microenvironmental+influences+in+the+normal+and+malignant+breast.">The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast.</a> Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+for+netrins+in+regulating+epithelial+behavior+during+lung+branching+morphogenesis.">Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis.</a> Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).</li><li>Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+assay+on+a+silicon+chip+applicable+for+tumors+extirpated+from+mammalians.">Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians.</a> International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+And+Environment+Interactions+In+Tumor+Microregions+-+The+Multicell+Spheroid+Model.">Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions - The Multicell Spheroid Model.</a> Science. 240 (4849), 177-184 (1988).</li><li>Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+microfluidic+technologies+for+cell-to-cell+interaction+studies.">Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies.</a> Lab on a Chip. , (2017).</li><li>Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sheet+approach+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).</li><li>Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips+at+the+frontiers+of+drug+discovery.">Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), (2014).</li><li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373 (2013).</li><li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant.">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481 (2013).</li><li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+In+Vivo+Origin+of+Metanephric+Nephron+Progenitors+Enables+Generation+of+Complex+Kidney+Structures+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 15, 177-200 (2013).</li><li>Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Approach+for+Formation+of+Vascularized+Liver+Tissue+by+Endothelial+Cell-Covered+Hepatocyte+Spheroid+Integration.">An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+fibroblasts+to+regulate+the+formation+of+three-dimensional+vessel-like+structures+from+endothelial+cells+in+vitro.">Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).</li><li>Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+assemble+into+a+3-dimensional+prevascular+network+in+a+bone+tissue+engineering+construct.">Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct.</a> Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).</li><li>Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+functional,+perfusable+3D+microvascular+networks+on+a+chip.">Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip.</a> Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).</li><li>Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Perfused+Human+Capillary+Networks.">In Vitro Perfused Human Capillary Networks.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).</li><li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device.">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li><li>Huang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+microscale+cellular+niches+for+three-dimensional+multicellular+co-cultures.">Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures.</a> Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).</li><li>Newman, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Stromal+Cell+Secretomes+Reveals+a+Critical+Role+for+Stromal+Cell-Derived+Hepatocyte+Growth+Factor+and+Fibronectin+in+Angiogenesis.">Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).</li><li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis:+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+lumen+formation.">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li><li>Griffith, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+limits+of+an+in+vitro+thick+prevascularized+tissue.">Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue.</a> Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+Liquid+Tumors:+An+In+Vitro+Assay+for+Leukemic-Cell-Induced+Bone+Marrow+Angiogenesis.">Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).</li><li>Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+developing+vasculature+and+optogenetically+engineered+skeletal+muscle+improves+muscle+contraction+and+angiogenesis.">Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis.</a> Biomaterials. 156, 65-76 (2018).</li></ol>

המחבר מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

דיווחים קודמים מראים כי hLFs מפרישים קוקטייל של מספר גורמי אנגיוגנזה, angiopoietin-1, angiogenin, hepatocyte פקטורי גדילה, שינוי צורה של גורם גדילה-α, הגידול נקרוזה מקדם, כמה מטריצה חוץ-תאית חלבונים29, 30. Assay הזה מסתמך על הפרשה האנגיוגנזה מ hLFs ב ספרואיד coculture, אשר הוא המגבלה של הטכניקה. לכן, זה קריטי עבור מערך כלי הדם יציב להגדיר ספרואיד coculture בתחתית הבאר כך המרחק בין ספרואיד coculture את HUVECs את ערוצים 1 ו- 3 יכול להתקצר. אורך כלי דם מן fibroblasts היה ביחס הפוך למרחק בין תאי אנדותל fibroblasts31, כך המרחק קצר היא יתרון עבור יציבה היווצרות כלי דם. עם זאת, לפתוח חור ספרואיד (1 מ מ קוטר) מבלי להזיק בערוצים 1 ו- 3, הרוחב המינימלי של ערוץ 2 היה 1.5 מ מ.
למרות ספרואיד ישקע בתחתית הבאר, שורשים וסקולרית נותקו לעתים microposts או microchannels (איור 5). במקרה זה, לא מגיב יכול להגיע לומן כלי הדם דרך microchannels (ערוצים 1 או 3). למרות שאנחנו לא יכול לפתור את הבעיה לחלוטין, אנחנו יכולים להניח שהבעיה היא בגלל מספר לא מספיק של HUVECs על פני השטח של הג'ל פיברין (שלב 4.2.1-4.2.6). ודא את HUVECs stably לצרף הקיר בצד של ערוץ 2.
לקראת הזריקה מוצלח של ספרואיד לתוך הבאר, אופטימיזציה של הקוטר הפנימיים והחיצוניים של טיפים micropipette בשלב 4.1.7 הוא חשוב: 1) הקוטר הפנימי צריך להיות גדול מזה של ספרואיד. 2) dimeter החיצוני צריך להתאים לקצה הטוב כך אין נזילה של הג'ל מתרחשת בחלק העליון של הבאר במהלך ההזרקה הטיפ ניתן להסיר בקלות לאחר הזרקת ג'ל. בפרוטוקול הנוכחי (φ1 מ מ ספרואיד טוב), כ-700 מיקרומטר הוא הקוטר המרבי עבור ספרואיד להזרקה. אם הקוטר טוב מיועד גדול מזה של פרוטוקול זה, יכול להיות מוזרק spheroids גדולים יותר בגלל הטיפ ניתן לחתוך יש קטרים הפנימי גדול יותר. ספרואיד קטרים ניתן לשלוט בקלות על-ידי שינוי מספר התא שנקטפו בצלחת 96-ובכן.
פרוטוקול זה מראה ראשית הרומן microfluidic פלטפורמה לבנות רשת כלי הדם perfusable ב ספרואיד. אמנם coculture עם HUVECs מאפשרת היווצרות של כלי דמוי מבנים בגודל23,18,ספרואיד24, היו אלה לא perfusable בשל קצות לומינה המלח. מכיוון שניתן לצפות פיברובלסט קיימים תאים ברקמות רב-תכליתי (עצם, adipocyte, סרטן, וכו '.), על ידי התוספת של כמה תאים מיקוד אחרים כדי ספרואיד coculture, אמוניה סוג שונים של spheroids, אשר יכול לחקות את ב ויוו הסביבה טוב יותר התרבות ספרואיד קונבנציונלי. כדי להרחיב את היישום של הטכניקה, העבודה העתידי יכלול את אמוניה spheroids ללא התוספת של פיברובלסטים. כמה האחרונות עבודות דו ח מח עצם תאי סטרומה32 ו שרירים תאים33 יכול לגרום אנגיוגנזה המכשירים microfluidic. ניצול תאי סטרומה או שריר במקום תאי פיברובלסט יגדילו את מספר רקמות זה יכול להיות vascularized את ההתקן microfluidic. פרוטוקול זה מספק פלטפורמה בסיסית רקמת vascularization, אשר היא טכניקה המיוחל בתחום של שלוש התרבויות תלת-ממדי.

המעבר בין תרבות (דו מימדי) חד שכבתי לתרבות תלת מימדי מונע ע י צורך לעבוד עם מודלים תרבות המחקים את הפונקציות הסלולר של חיים רקמות1,2,3. מצעים פלסטיק שטוחה וקשה נפוץ תרבית תאים לא דומים ביותר של סביבות חוץ-תאית בגוף האדם. למעשה, מחקרים רבים להפגין ארכיטקטורה תלת מימדי התרבות הזו של רקמות ספציפיות לשחזר מכני וביוכימי רמזים, תקשורת, אשר לא נצפו תרבות דו מימדי קונבנציונאלי4, 5,-6,-7,-8.
צבירה multicellular ספרואיד, הוא אחד של טכניקות המבטיחים ביותר להבין זה תלת מימדי התרבות9,10. התאים המפרישים את מטריצה חוץ-תאית (ECM), יכולים לקיים אינטראקציה עם אחרים ספרואיד. למרות כמה אחרים בביו-הנדסה מתקרב11,12,13,14, כגון תא בערימה, בהצלחה לשכפל את המורכבות המרחבי של הגוף האנושי, הגישות הללו יש רק שניים או שלושה סוגים של תאים עבור להקל על ניתוח ממוקד רק תפקיד אחד של אברי המטרה. לעומת זאת, תאים spheroids חשופים לסביבות תרבות שונים בהתאם עמדותיהם ספרואיד בשל הטרוגניות אספקת חומרים מזינים, חמצן, ואת paracrine autocrine מולקולות ב ספרואיד איתות. תכונה זו של spheroids מחקה באופן חלקי ויוו תרבות תנאי, ומאפשרים התאים spheroids ליצירת רקמות מורכבים הרבה יותר, מאורגנת מבנה במבחנה מאלה תרבותי הערימה רקמות9, 15 , 16. הערה אם ספרואיד מורכבת מסוג אחד של תאים, תפקוד התאים ספרואיד אינו אחיד עקב בסביבה הטרוגנית ספרואיד. בשנים האחרונות, ספרואיד תרבויות מותר בתאי גזע pluripotent בתאי גזע עובריים (ESCs), המושרה (iPSCs) או בתאי גזע רקמות תושב לחקות ויוו רצפים התפתחותיים ואף ליצור מיני-איברים כגון המוח17, הכבד18ו כליות19,20.
למרות התקדמות משמעותית בשיטות תרבות ספרואיד, culturing spheroids גדול במשך זמן רב הוא עדיין בעייתי. טישו תלת מימדי, תאים צריך להיות ממוקם בתוך 150-200 מיקרומטר של כלי דם בגלל אספקת חמצן וחומרים מזינים21מוגבלת. רשתות כלי דם בתוך ספרואיד נחוצים לסכם החלפת חומרים בין הדם ורקמות בתוך vivo. כדי להשיג זאת, קבוצות אחרות משותף תרבותי תאי אנדותל עם היעד תאים22,23,24 או המושרה את הבידול של תאים pluripotent לתוך תאים CD31-חיוביות20. ובכל זאת, המבנים כלי דמוי דווח על אין סוף פתוח לומינה לאספקת חמצן וחומרים מזינים למרכז ספרואיד. כדי לחקות את תפקיד כלי הדם לטפח תאים בתרבות תלת מימדי, פתוח, perfusable רשת כלי הדם חייב להיות שפותחה ב- ספרואיד.
במהלך השנים האחרונות, כמה קבוצות מחקר בתחום microengineering דיווח שיטות לבנות רשת כלי דם perfusable, באופן ספונטני הנוצרת במכשיר microfluidic על-ידי ניצול גורמי אנגיוגנזה מתאי פיברובלסט cocultured25 ,26. רשתות אלה כלי הדם יש של המורפולוגיה דומה לכלים המקבילים ויוו , יכול להיות שופצה על ידי גורמים סביבתיים, שהופך אותם למתאימים עבור מחקה פונקציות וסקולרית בתרבות ספרואיד. המטרה של פרוטוקול זה היא לבנות רשת כלי הדם perfusable ב ספרואיד באמצעות פלטפורמה של microfluidic27. המכשיר microfluidic הוא שונה התקן שדווחה בעבר25 כך ספרואיד ניתן לשלב. על ידי הפניית הפרשה אנגיוגנזה של תאי פיברובלסט ספרואיד לתאי אנדותל של microchannels, האנגיוגנזה נבטים של microchannels את anastomosed עם ספרואיד ויצרו רשת כלי הדם perfusable. שיטה זו מאפשרת משלוח ישיר של מגוון רחב של חומרים, כגון פלורסנט מולקולות וחרוזים מיקרומטר-סולם אל פנים ספרואיד, אשר מספקת את המסגרת תרביות רקמה לטווח ארוך עם רשתות כלי דם.

<table><tbody><tr><td>AutoCAD 2017</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2017</td><td></td></tr><tr><td>A chromium mask coated with AZP 1350.</td><td>CLEAN SURFACE TECHNOLOGY</td><td>CBL2506Bu-AZP</td><td></td></tr><tr><td>Micro pattern generator</td><td>Heidelberg</td><td>uPG101</td><td></td></tr><tr><td>MF CD-26 developer</td><td>Rohm and haas electronic materials</td><td>-</td><td>Developer in protocol 1.4</td></tr><tr><td>S-Clean</td><td>Sasaki Chemical</td><td>S-24</td><td>Chromium etchant in protocol 1.5</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Wako</td><td>012-00343</td><td></td></tr><tr><td>Silicon Wafer</td><td>Canosis</td><td>SiJ-4</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>MIKASA</td><td>1H-D7</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td><td>Tokyo Ohka Kogyo</td><td>H0089</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>MicroChem</td><td>-</td><td>Negative photoresist in protocol 1.9</td></tr><tr><td>UV Exposure</td><td>Nanometric Technology Inc</td><td>LA310s</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td>Developer for the negative photoresist in protocol 1.13</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Wako</td><td>163-04841</td><td></td></tr><tr><td>Surface profiler</td><td>Veeco</td><td>Veeco Dektak XT-S</td><td></td></tr><tr><td>(Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane</td><td>Sigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Toray</td><td>184W/C</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Punch (1.0mm)&amp;nbsp;</td><td>Kai Industries</td><td>BP-10F</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Punch (2.0mm)&amp;nbsp;</td><td>Kai Industries</td><td>BP-20F</td><td></td></tr><tr><td>Plasma System</td><td>Femto Science</td><td>COVANCE</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>MATSUNAMI GLASS</td><td>C024241</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dishes</td><td>Iwaki</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell</td><td>Angio Proteomie</td><td>cAP-0001RFP</td><td></td></tr><tr><td>Normal Human Lung Fibroblasts</td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Media Kits</td><td>Lonza</td><td>CC-3132</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA&amp;bull; 4Na Solution with Phenol Red</td><td>Wako</td><td>204-16935</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Phosphate Buffered Salts)</td><td>Takara bio</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Sumitomo bakelite</td><td>631-21031</td><td></td></tr><tr><td>1000ul Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-402</td><td></td></tr><tr><td>200ul&amp;nbsp; Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-301</td><td></td></tr><tr><td>10ul Chip</td><td>NIPPON Genetics</td><td>37650</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Model 370</td><td></td></tr><tr><td>GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell</td><td>Angio Proteomie</td><td>cAP-0001GFP</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin from bovine lung</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H21492</td><td>Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution</td><td>Wako</td><td>163-25983</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Fluorescence Microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Degital CCD Camera</td><td>OLYMPUS</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Biological Microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Fluorescence Microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>IX-83</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate-dextran</td><td>Sigma</td><td>FD70S</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusable vascular network with a tissue model in a microfluidic device

ספרואיד (צבירה multicellular) נחשב מודל של חיים רקמות בגוף האדם. למרות קידום משמעותי בתרבויות ספרואיד, רשת כלי הדם perfusable ב spheroids עדיין אתגר קריטי לתרבות לטווח ארוך נדרש לשמור ולפתח את הפונקציות שלהם, כגון חלבון ביטויים מורפוגנזה. הפרוטוקול מציג שיטה להשתלב רשת כלי הדם perfusable בתוך ספרואיד התקן microfluidic. כדי לגרום לרשת כלי הדם perfusable ספרואיד, הונחו נבטים האנגיוגנזה מחובר microchannels כדי ספרואיד ניצול גורמי אנגיוגנזה של אמבריולוגיה fibroblasts תרבותי ב ספרואיד. נבטים האנגיוגנזה הגיעו ספרואיד, התמזגה עם תאי אנדותל ותרבותית משותפת ב- ספרואיד, ויצרו רשת כלי דם רציפה. רשת כלי הדם יכול perfuse את הפנים של ספרואיד ללא דליפה כלשהי. נבנה לרשת כלי הדם ניתן להשתמש עוד יותר עבור אספקה של חומרים מזינים והסרה של חומרי פסולת, מחקה את זרימת הדם בתוך vivoכמו מסלול. השיטה מספקת פלטפורמה חדשה בתרבות ספרואיד לכיוון נעלה יותר של רקמות החי.

איור 1 מראה של עיצוב תמונה של המכשיר microfluidic. . יש לו שלושה ערוצי מקבילים, איזה ערוץ 2 מכיל את ספרואיד טוב... בערוצים 1 ו- 3 משמשים את התרבות HUVEC, ערוץ 2 מיועד ספרואיד. בכל אחד מהערוצים מופרדת באמצעות microposts הבסיסי נועד דפוס PDMS. Microposts למנוע את הידרוג בערוץ 2 דולפים לתוך בערוצים 1 ו- 3 על ידי מתח ומאפשרים החלפת חומרים בין ספרואיד HUVECs microchannels28.
איור 7 א מראה המרכז של מכשיר microfluidic לאחר תא זריעה. שדה בהיר ובדימויים פלורסנט ביום 0 מראים כי פיברין ג'ל מלא רק ערוץ 2 ללא כל דליפה לתוך בערוצים 1 ו- 3, HUVECs לחבר בהצלחה sidewall של הג'ל פיברין. התמונה שדה בהיר היא בפוקוס על ספרואיד בשני טעון, microposts, המציין ספרואיד כראוי התיישבו בחלק התחתון של המכשיר. נבטים האנגיוגנזה הם נצפו על יום 1 והאורך של נבטים גדל עם הזמן, (איור 7 ב). ביום 3, נבט הארוך הגיע ספרואיד את והגיעה ביום 7, רוב נבטים האנגיוגנזה ספרואיד (ממוצע המרחק בין הערוצים 1 ו-3 מיקרומטר < 500 ספרואיד). במקרה הטוב, אחרי ארבעה ימים בתרבות התקן, הזרימה לומן כלי הדם יכול להיות שנצפו. הזווית כלי הדם היה הגדיר את ההוראות של קצה וסקולרית ומרכז ספרואיד מן השורש כלי הדם. איור 7c מראה הזווית וסקולרית כימות במהלך 7 ימים בתרבות התקן. הזוויות כלי הדם ירד באופן תלוי-זמן, המציין כי נבטים האנגיוגנזה להעביר לקראת ספרואיד.
איור 8 מציין את המקטע של רשת כלי הדם שבו שמיזגת RFP-HUVECs ו- GFP-HUVECs. RFP-HUVECs ו- GFP-HUVECs נוצרו coordinately של לומן כלי דם בודדת כפי שמוצג על ידי ראשי חץ, אשר בבירור לציין האנגיוגנזה נבטים מערוצים 1 ו- 3 anastomosed כדי RFP-HUVECs ב ספרואיד ויצרו רשת כלי דם רציפה. כדי לאשר את perfusability של רשת כלי הדם, FITC-לתוספי היה מוזרק לתוך ערוץ 1. FITC-לתוספי בערוץ 1 זרמו לתוך נבנה רשת כלי הדם ואת הפנים של ספרואיד והגיעה לבסוף ערוץ 3 (איור 9). במהלך זלוף של FITC-לתוספי פתרון, יש זליגת מהרשת כלי הדם לחלל extravascular. היא שודרה בעבר כי מולקולות קטנות, תזריקו לומן כלי הדם עוברים דרך דופן כלי הדם, להגיב עם התאים באזורים extravascular. בנוסף, המקדם חדירות של רשת כלי הדם הוצגה להיות קרובים הזה אין ויוו27. תוצאות אלו לרמז רשת כלי דם משולב יכול לספק את החומרים המזינים את ספרואיד ולהסיר תוצר הפסולת.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig1.jpg"> איור 1 : עיצוב, תמונה של המכשיר microfluidic. (א) סקירה של העיצוב של המכשיר microfluidic. התחום האפור מציין שלושה ערוצי microfluidic מופרדים על-ידי microposts הבסיסי. ערוץ 2 יש בו טוב עבור תרבות ספרואיד. איור נכון מציג בתצוגה מוגדלת במלבן אדום בצד שמאל. (ב) תצלום של המכשיר microfluidic ערוצי שלהם מלאים דיו אדום. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig2.jpg"> איור 2 : זמן הניסוי. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig3v2.jpg"> איור 3 : שיטה כדי לטעון ספרואיד לתוך המכשיר microfluidic. (א) ביצוע טיפה של MS והתקשורת עם ספרואיד שני כלים נפרדים. לאחר מכן, העבר את ספרואיד לתוך MS תרומבין. (ב) מבט חתך סכימטי המכשיר במהלך ההזרקה של ספרואיד. סכום עודף של ג'ל זורם החוצה דרך חורים 2A ו- 2B. עם זאת, ספרואיד נשאר בתחתית המכשיר בשל כליאה פיזית. (ג) מפרטים טכניים של המכשירים כאשר הם בתוך אינקובטור. Kimwipe רטוב הונח בצלחת 100-מ מ, שתי מנות 35 מ מ עם המכשיר מדדת את Kimwipe. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig4.jpg"> איור 4 : הצילומים של טיפים פיפטה גזור תא זריעה על המכשיר- הקצה הלבן השמאלי הוא חורים 1A, 1B, 3 א, 3 ג, ספרואיד המעביר לצניחה של פיברין ג'ל (שלבים 4.1.9, 4.1.13, 4.2.4 ו 4.2.6). הטיפ הצהוב האמצעי הוא אוסף ספרואיד מ 96-ובכן (שלב 4.1.7). הטיפ נכון לבן היא הבאר ספרואיד (שלב 4.1.11). הטיפים לפני גזור מוצגים גם בצילום. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig5.jpg"> איור 5 : להערכת הלא perfusable. אנגיוגנזה נבטים של microchannels לא התחבר אל הפתח בין microposts ואיבד את החיבור בין לומן microchannels (חיצים שחורים). זה נגרם על ידי HUVECs לא מספיק נזרע בערוצים 1 ו- 3. אדום: RFP-HUVECs ב ספרואיד, ירוק: GFP-HUVECs של microchannels. התאים היו תרבותי במכשיר למשך 14 ימים. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig6v2.jpg"> איור 6 : הגדרה של השורש וסקולרית, עצה, מרכז ספרואיד. (א). שיטת כדי לקבוע את המיקום של שורש כלי הדם, עצה כדי למדוד את אורך נבט. לאחר יישור תמונות בצילום מואץ פלורסנט, התמונה פלורסנט לקח כמה ימים לאחר culturing במכשיר יופחת לפי התמונה ביום 0. מדדנו את האורך של הנבטים לאחר החיסור באמצעות תוכנת ImageJ. (ב) הגדרה של מרכז ספרואיד. הדימויים פלורסנט RFP-HUVECs binarized, נמדדת ב centroid שלה ImageJ תוכנה. אנו מגדירים את centroid למרכז ספרואיד. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig6v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig7.jpg"> איור 7 : היווצרות רשת כלי דם במכשיר microfluidic. (א) תמונות בצילום מואץ של מרכז של מכשיר microfluidic לאחר תא זריעה. אדום: RFP-HUVECs תרבותי ב ספרואיד, ירוק: GFP-HUVECs שנקטפו בערוצים 1 ו- 3. ניתוח כמותי של נבט אורך (b), זווית כלי דם (c) (n = 42 נבטים בהתקנים 3, קווי השגיאה לציין את תקן שגיאות (S.E.)). אורך נבט מוגדר כהמרחק בין המיקום של HUVECs ביום 0 לקצה וסקולרית (ב', בראש). הזווית (∠TRS) הוגדרה על ידי השורש וסקולרית (R), טיפ (T) מרכז ספרואיד (S) (c, למעלה). ראה איור 6 עבור ההגדרה של בסיס כלי הדם, עצה, מרכז ספרואיד. נתונים אלה התקבלו באמצעות תוכנת ImageJ. התרשימים המסביר את ההגדרה של אורך ספראוט וזווית כלי הדם עוברות שינוי מ Nashimoto, י. ואח 27. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig8v2.jpg"> איור 8 : היווצרות של לומן כלי דם על-ידי HUVECs מן microchannels את ספרואיד. (א) פלורסנט תמונה של סקירה כללית של המדגם לאחר 14 ימים בתרבות התקן. מלבן צהוב מציין המיקום x-y של המקטע אופטי שמוצג (b). (ב) x-y, y-z ו- x-z סעיף אופטי של רשת כלי דם שלא נבנה. חיצים לבנים מציינים לומן כלי הדם. אדום: RFP-HUVECs תרבותי ב ספרואיד, ירוק: GFP-HUVECs תרבותי ב microchannels את, כחול: גרעינים הסלולר. (א) מראה אין קרינה פלואורסצנטית כחול כי (א) התמונה לפני הקיבעון. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig8v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57242/57242fig9.jpg"> איור 9 : זלוף של ספרואיד באמצעות רשת כלי דם שלא נבנה. שדה בהיר (a) ופלורסנט (ב) תמונות של ספרואיד לאחר 7 ימים בתרבות התקן. (ג) פלורסנט דימוי ספרואיד אותו לאחר FITC-לתוספי (70 kDa) טעינה. אדום: RFP-HUVECs ספרואיד ו בערוצים 1 ו- 3, ירוק: FITC-לתוספי, כחול: גרעינים הסלולר. <a href="/files/ftp_upload/57242/57242fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
1 הקבצים המשלימים: העיצוב של המכשיר microfluidic. הקובץ הוא בפורמט dxf. <a href="/files/ftp_upload/57242/Supplementary_File_1.dxf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device at JoVE.com

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

רשת כלי הדם perfusable עם דגם רקמה במכשיר Microfluidic

הפרוטוקול מתאר כיצד מהנדס רשת כלי הדם perfusable ב ספרואיד. Microenvironment שמסביב של ספרואיד הוא פיתח כדי לגרום אנגיוגנזה ולהתחבר ספרואיד של microchannels את התקן microfluidic. השיטה מאפשרת את זלוף של ספרואיד, אשר היא טכניקה המיוחל בתרבויות תלת מימדי.

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

perfusable-vascular-network-with-tissue-model-microfluidic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.8K Views.  Kyoto University. הפרוטוקול מתאר כיצד מהנדס רשת כלי הדם perfusable ב ספרואיד. Microenvironment שמסביב של ספרואיד הוא פיתח כדי לגרום אנגיוגנזה ולהתחבר ספרואיד של microchannels את התקן microfluidic. השיטה מאפשרת את זלוף של ספרואיד, אשר היא טכניקה המיוחל בתרבויות תלת מימדי.

Video: Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

מיקרופלואידיקה Endothelialized לחקר אינטראקציות כלי הדם במחלות המטולוגיות

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

טכניקת microfluidic Genipin הפקדת לתרבות מורחבת של כלי דם micropatterned השרירים Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

הכנת מודל מיקרו-גידולי וסקולרי אנושי מבוסס מיקרופלואידיקה

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

מחבר זרקור: יצירת מיקרו-גידולים וסקולריים אנושיים כמודלים לחקר סרטן תרגומי 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

הקמת מודל פיזיולוגי למיקרו-גידולים וסקולריים אנושיים לחקר הסרטן

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

Cancer Research

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

תמונה מונחה, ייצור מבוסס-לייזר של רשתות Microfluidic הנגזרות דם

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the initial stage varies dramatically from the following process of neovascularization. Although there are plenty of models to simulate different stages of neovascularization, an in vitro 3D model that capitulates the initial process of neovascularization under the corresponding stimulations of normal vasculature microenvironments is still lacking. Here, we reconstructed an in vitro 3D model that mimics the initial event of neovascularization (MIEN). The MIEN model contains a microfluidic sprouting chip and an automatic control, highly efficient circulation system. A functional, perfusable microchannel coated with endothelium was formed and the process of sprouting was simulated in the microfluidic sprouting chip. The initially physiological microenvironment of neovascularization was recapitulated with the microfluidic control system, by which ECs would be exposed to high luminal shear stress, physiological transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distributions simultaneously. The MIEN model can be readily applied to the study of neovascularization mechanism and holds a potential promise as a low-cost platform for drug screening and toxicology applications.

Here, we provide a microfluidic chip and an automatically controlled, highly efficient circulation microfluidic system that recapitulates the initial microenvironment of neovascularization, allowing endothelial cells (ECs) to be stimulated by high luminal shear stress, physiological level of transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distribution simultaneously.

מודל מיקרופלואידי לחקות אירוע ראשוני של ניאו-סקולריזציה

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

רשת כלי הדם perfusable עם דגם רקמה במכשיר Microfluidic

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מיקרופלואידיקה Endothelialized לחקר אינטראקציות כלי הדם במחלות המטולוגיות

טכניקת microfluidic Genipin הפקדת לתרבות מורחבת של כלי דם micropatterned השרירים Thin Films

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

הקמת מודל פיזיולוגי למיקרו-גידולים וסקולריים אנושיים לחקר הסרטן

הקמת מודל פיזיולוגי למיקרו-גידולים וסקולריים אנושיים לחקר הסרטן

הקמת מודל פיזיולוגי למיקרו-גידולים וסקולריים אנושיים לחקר הסרטן

תמונה מונחה, ייצור מבוסס-לייזר של רשתות Microfluidic הנגזרות דם

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

מודל מיקרופלואידי לחקות אירוע ראשוני של ניאו-סקולריזציה

פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית