עבודה זו נתמכה על ידי ה-NSF הקריירה פרס 1553023 ופרס NIH/NIAID R01AI103369.

1. גידול של Pseudomonas aeruginosa Biofilms המושבה
<ol><li>הכנת לוחות בינוני-Bilayer<ol>
<li>להכין עם 10 גרם/ליטר טריפטון, אגר 10 גרם/ליטר (ראה טבלה של חומרים) פתרון במים יונים.</li>
		<li>אוטוקלב במשך 20 דק מגניב ל 50-60 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.</li>
		<li>שופכים 45 מ של הפתרון אגר-טריפטון לתוך תבשיל מרובע 100 מ"מ x 100 מ"מ (ראה טבלה של חומרים) באמצעות צינור חרוטי 50-mL. לאפשר את אגר לגבש (~ 20-30 דקות). שופכים שכבה שנייה, 15-mL על גבי השכבה הראשונה. תן לחזק בן לילה, הסרת עיבוי של העפעפיים במידת הצורך על ידי מנגב עם טישו נטולת מוך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תצפיתנות כלי Biofilms המושבה<ol>
<li>פסים הזנים של ריבית מן המקפיא מניות על פלטות אגר LB13 , דגירה בחושך 12-16 h ב- 37 מעלות צלזיוס ו- 80-100% לחות יחסית.</li>
		<li>עבור כל זן או שכפול, להשתמש מושבה בודדת ועד לחסן 2 מ ל LB דגירה בחושך 12-16 קמ"ש ב 37 ° C עם רועדת-250 סל"ד.</li>
		<li>תת תרבות על ידי דילול מטריים לתוך טריים LB ואת המקננת בחושך 2.5-3 h ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-250 סל"ד.</li>
		<li>למדוד צפיפות אופטית באמצעות ספקטרופוטומטרים ולהתאים עם LB סטרילי כדי להשיג השעיה תא עם מנת יתר500 nm של ~ 0.5.</li>
		<li>בהתאם המושבה הרצוי גודל, µL pipet 2.5-10 של התא השעיה על צלחת בינונית-bilayer (להכין בשלב 1.1) ולאפשר במקום להתייבש במשך ~ 20 דק. עוזב את המכסה פטרי אג'ר ליד להבה פתוחה יכול להקל על ייבוש.</li>
		<li>דגירה מושבות ספוט-25 ° C ו- 80-100% לחות, בחושך עד 4 ימים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת הפתרון מקבע
<ol><li>להכין את הפתרון לשבועיים ביום של מדגם קציר. לדלל 37% פורמלדהיד (FA) ב- PBS 1 x כדי ריכוז סופי של 4% הפא. התראה: הפא הוא תנודתי, רעיל. ללבוש ציוד מגן ולעבוד בשכונה-fume מאוורר היטב.</li>
	<li>מיד לפני שימוש, להתמוסס L-ליזין הידרוכלוריד ב 4% פא (להכין בשלב 2.1) בטמפרטורת החדר כדי ריכוז סופי של 50 מ מ L-ליזין HCl.</li>
</ol>3. ישירה ליישום של מקבע המושבה Biofilm [אופציונלית]
הערה: מצאנו כי biofilm מורפולוגיה נשמר בצורה הטובה ביותר כאשר הכיסוי אגר נוספת לפני קיבוע. עם זאת, שלב זה מהווה גם שינוי בתנאים סביבתיים יכולים להשפיע על ביטוי גנים. כתב פלורסנט ביטוי דפוסי צריכה ולכן אפשר יהיה לאמתו באמצעות פרוטוקול נפרד שבו הצעד קיבוע מבוצע לפני התוספת של הכיסוי אגר, כפי שמתואר כאן.
<ol><li>ביום של קיבעון, והוא פועל בשכונה-fume מאוורר היטב, pipette מקבע את מוכנה בשלב 2 ישירות אל פני השטח אגר סביב הקצה של המושבה, ולאפשר לו להגיע לפריפריה של המושבה בלי השוקע זה. חלים רק כמו הרבה מקבע כמו יש צורך מלא להקיף את המושבה, כ-500 µL. להתיר את מקבע לנטרל לתוך המושבה, אגר המקיפים.</li>
	<li>ברגע מקבע כבר מלא נספג לתוך המושבה ומדיה שמסביב, בערך 20-30 דקות, הפא שיורית אינה גלויה על הצלחת, חזור על שלב 3.1. לאפשר זה מקבע לנטרל לתוך המושבה, על אגר שמסביב.</li>
	<li>ברגע מקבע כבר מלא נספג לתוך המושבה, מדיה שמסביב חזור על שלב 3.1, הפעם החלת מקבע פני השטח של המושבה ישירות. לאפשר זה מקבע לנטרל לתוך המושבה, על אגר שמסביב, ממשיך לשלב 4 רק אחרי הכל מקבע כבר נספג, אינה גלויה על הצלחת.</li>
</ol>4. overlaying מושבות עם אגר
<ol><li>ביום של קיבעון, להכין 10 גרם/ליטר פתרון אגר מים יונים, החיטוי במשך 10-20 דקות להתמוסס. מגניב באמבט מים כדי 50 הלעפה תרוטרפמט</li>
	<li>שופכים בעדינות 15 מ"ל של הפתרון אגר מדיום הגידול ואת המושבה. לאפשר את אגר ליצירת ג'ל בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות (איור 1B).</li>
	<li>השימוש סכין גילוח חדה לחתוך של צ'אק מרובע, 3-שכבה עם המושבה למינציה בין שתי השכבות העליון. אם הכנת דוגמאות מרובים, ודא כי כל צ'אק הוא חתך לגודל דומה.</li>
	<li>הסר בעדינות אגר עודף הצ'אק המכיל מושבת.</li>
	<li>כדי להרים את שתי השכבות העליונות של אגר (המכיל את המושבה) מן השכבה התחתונה של הצ'אק (איור 1C), להרטיב ראש שטוח מרית 1 x PBS או מים ולהוסיף בעדינות בין הרבדים העליונים והתחתונים. המושבה למינציה צריך להפריד בין השכבה התחתונה. יש להיזהר לא לעוות או לכופף את המושבה למינציה בעת הרמת זה מבסיסו.</li>
</ol>5. קיבוע
<ol><li>עובד בברדס fume מאוורר היטב, להעביר מיד המושבה למינציה (קרי, צ'אק 2-שכבה) לתוך קלטת ההטבעה (ראה טבלה של חומרים), שכותרתו עם עט סימון עמיד כימי. למקם את הקלטת ההטבעה למבוטחים שקופיות זכוכית (ראה טבלה של חומרים) המכיל את מקבע שהוכנו בשלבים 2.1-2.2. ודא כי ישנם אין בועות אוויר לכוד בתוך בקלטת ההטבעה.</li>
	<li>דגירה המדגם לשבועיים בן לילה בחושך בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>6. דוגמת עיבוד: מאגר לשטוף, התייבשות, סליקה, הסתננות
<ol><li>לאחר קיבוע בין לילה, לשטוף את הדגימה פעמיים ב- PBS 1 x על 1 h. לקבלת תוצאות מיטביות, להפוך לאוטומטיות המגון ריאגנט להשתמש במהדורה הפונקציה של מעבד רקמות אוטומטית (ראה טבלה של חומרים) מוגדר קביעת ערך נמוך. אם המעבד לא זמין, ניתן להפעיל עיבוד ידני.</li>
	<li>פעל לשטוף את מאגר על-ידי התייבשות באמצעות סדרת דילולים אתנול (EtOH) ב- PBS 1 x (25%, 50%, 70%, 95%) מדורגת 1 h כל בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מייבשים ב שלושה שוטף של 100% EtOH על 1 h כל בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>נקה המדגם מיובש ב שלושה שוטף של סוכן ניקוי על בסיס שמן תפוז 100% (ראה טבלה של חומרים) עבור 1 h כל בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לחדור הדגימה שנוקה פעמיים עם שעווה מותכת שעווה (ראה טבלה של חומרים), מחומם ל 55˚C, כבר שעתיים כל אחד.</li>
</ol>7. דוגמאות הטבעה
<ol><li>ממלאים תבנית שעווה מותכת פרפין מחומם ל הלעפה תרוטרפמט 55. השתמש מרית מחוממת שטוחים, להעביר במהירות את הצ'אק הסתנן מ בקלטת ההטבעה לתבנית שעווה, המבטיח הצ'אק. מונח מקביל לבסיס התבנית. למנוע הפעלת לחץ יתר על גבי הצ'אק. שעווה בתבניות ייתכן תלת-ממדי מותאמת אישית מודפס, או אינם זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים).</li>
	<li>אפשר שעווה לגבש בין לילה-הלעפה תרוטרפמט 4. ניתן לאחסן דגימות יצוק ומצופה בשעווה מוצק ללא הגבלת זמן-4 הלעפה תרוטרפמט.</li>
	<li>לאחר השעווה התחזק, לסלק את הדגימה של העובש ולחיתוך שעווה עודפת מ מסביב הדגימה. עם סכין גילוח. להשאיר עודף שעווה הארכת מקצה אחד של המדגם, מקביל למישור חלוקתה, זה יכול לשמש כדי. תהדק את זה לתוך האזמל הקטן (ראה טבלה של חומרים). גם יוצאים נדן ווקס, כ 1 מ מ עבה, סביב המדגם, להחליק את הפנים שלה.</li>
</ol>8. חלוקתה
<ol><li>חום באמבט מים כדי הלעפה תרוטרפמט 42. תהדק את המדגם לתוך האזמל הקטן עם פני השטח של המושבה מונחה בניצב על קצה הלהב (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>חתוך את הדגימה במרווחים 50-מיקרומטר עד הגיעה למטוס הרצוי של המושבה, שממנו ייאספו מקטעים.</li>
	<li>חותך רצועה של המספר הרצוי סעיפים בעובי 10-מיקרומטר באמצעות מיקרוטום של הגדר מהירות אופטים של 75-80 סל"ד ואת זווית סיווג של 6-10˚ להשתמש במכחול שקצהו הקנס כדי לנתק את רצועת הכלים של הלהב.</li>
	<li>באמצעות טיפת מים בקצה של פסטר פיפטה (מועדפת) או מלקחיים, להעביר בעדינות את רצועת הכלים המים הרותחים. להיות זהירים כדי למנוע השמנה בועות אוויר תחת המקטע.</li>
	<li>מיד להוסיף שקופית לאמבט מים ומקם אותה מתחת לרצועת הכלים בזווית של 45˚.</li>
	<li>לגעת בקצה הצר של רצועת הכלים אל השקופית, רק מתחת לתווית עמומה. רצועת הכלים צריך לדבוק.</li>
	<li>משוך את השקופית מהאמבטיה מים, התאמת הזווית להיות בניצב למשטח של המים, ומאפשר הכלים כדי להשתטח נגד השקופית לאורכו. למנוע השמנה עודף מים מתחת לרצועת הכלים.</li>
	<li>בעדינות לעמוד השקופית אל סופג נטולת רקמות, הפתילה המים העודפים מהסעיף.</li>
	<li>להניח את השקופית על מגבת נייר, ולאפשר לו להתייבש בטמפרטורת החדר למשך הלילה בחושך. ניתן לאחסן שקופיות ללא הגבלת זמן-4 הלעפה תרוטרפמט בחושך.</li>
</ol>9. חום-תיקון התייבשות, הרכבה
<ol><li>מחממים תנור מפולס כדי הלעפה תרוטרפמט 45. מחממים את השקופית למשך 30-60 דקות. השעווה להיות מותך למחצה ולשטח נגד השקופית.</li>
	<li>בעדינות להרים את השקופית מ הכיריים ושים אותה שטוח על משטח חלק, מפולס, בטמפרטורת החדר, באמצעות טיפול להבטיח כי שעווה מותכת לא למשוך בכל צד של השקופית, עד שהשעווה עפור (~ 1 דקה).</li>
	<li>באמצעות הדיוור שקופיות זכוכית, שעווה מבטל את השקופיות ארבע שוטף של הבהרת סוכן עבור 5 דקות כל אחד, באמצעות ליניקת ביכנר כדי להסיר את הפתרון בין שוטף.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות שלוש פעמים ב-100% EtOH עבור 1 דקות כל אחד.</li>
	<li>נתרענן השקופיות בסדרה מדורגת של אתנול בסדר ההפוך של עיבוד (95%, 70%, 50% ו- 25%) 1 דקות, ולאחריו שוטף 1-מין שני ב- 1 x PBS.</li>
	<li>מיד הר הסעיפים במדיום באגירה טריס הרכבה (ראה טבלה של חומרים) ולהחיל על coverslip, הימנעות המבוא של בועות אוויר. לאפשר הרכבה בינוניים עד פולימריזציה ללילה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>ברגע polymerized, חותם את coverslip אל השקופית באמצעות לק ברורה. ניתן לאחסן שקופיות אטום ללא הגבלת זמן בחושך-הלעפה תרוטרפמט 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-quantitative+approach+to+assess+biofilm+formation+using+wrinkled+colony+development.">A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development.</a> J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).</li><li>Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+involved+in+matrix+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilms.">Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms.</a> Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).</li><li>Okegbe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-shuttling+antibiotics+structure+bacterial+communities+by+modulating+cellular+levels+of+c-di-GMP.">Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).</li><li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community.">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).</li><li>Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanatomy+at+cellular+resolution+and+spatial+order+of+physiological+differentiation+in+a+bacterial+biofilm.">Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm.</a> MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).</li><li>Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+as+an+architectural+element+in+spatially+structured+Escherichia+coli+biofilms.">Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms.</a> J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).</li><li>McGlinn, E., Mansfield, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+gene+expression+in+mouse+embryos+and+tissue+sections.">Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).</li><li>Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Detection+of+Bacteria+within+Paraffin-embedded+Tissues+Using+a+Digoxin-labeled+DNA+Probe+Targeting+16S+rRNA.">In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA.</a> J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).</li><li>James, G., Hunt, A. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Biofilms+in+Tissue+Specimens.">Imaging Biofilms in Tissue Specimens.</a> Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).</li><li>Madsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facultative+control+of+matrix+production+optimizes+competitive+fitness+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilm+models.">Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).</li><li>Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -. C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orphan+cbb3-type+cytochrome+oxidase+subunit+supports+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+growth+and+virulence.">An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence.</a> bioRxiv. , 171538 (2017).</li><li>Fong, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+RbmA+governs+plasticity+of+Vibrio+cholerae+biofilms.">Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysogeny+at+mid-twentieth+century:+P1,+P2,+and+other+experimental+systems.">Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems.</a> J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-active+antibiotics+control+gene+expression+and+community+behavior+in+divergent+bacteria.">Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria.</a> Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).</li><li>Zupan&#269;i&#269;, D., Ter&#269;elj, M., &#352;trus, B., Verani&#269;, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+obtain+good+morphology+and+antigen+detection+in+the+same+tissue+section?.">How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section?.</a> Protoplasma. , (2017).</li><li>Priester, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+visualization+of+microbial+biofilms+by+staining+and+environmental+scanning+electron+microscopy.">Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy.</a> J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).</li><li>Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fixative+for+the+preservation+of+actin+filaments:+fixation+of+pure+actin+filament+pellets.">A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets.</a> J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).</li><li>Blackburn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+normal+and+abnormal+placentation+in+the+mouse.">Examination of normal and abnormal placentation in the mouse.</a> Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).</li><li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+crosslinking:+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes.">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li><li>Jennings, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pel+is+a+cationic+exopolysaccharide+that+cross-links+extracellular+DNA+in+the+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+matrix.">Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

דגימות רקמה הטבעה-פרפין, דק-חלוקתה היא טכניקה היסטולוגית הקלאסי מאפשר הדמיה של מבנה מיקרו-מורפולוגי, משמש בדרך כלל על רקמות האיקריוטים ולאחר הוחלה בהצלחה מסוימת על חיידקים דגימות8 ,9. בעוד cryoembedding מאפשר שמירה חזקה של אות אנדוגני, immunofluorescent, פרפין הטבעת היא כלל עדיף כפי ומוצריה יותר מורפולוגיה16. בהתאמת בשיטה זו עבור יישום כדי חיידקים פתוגנים המועברים במזון, התמקדנו מאפיינים ייחודיים למערכת שלנו. התאים ואת מטריצה של רקמות לעיתים קרובות מוחזקים ביחד יחסית robustly, בעוד biofilms נוטים להיות עדין יותר; אנחנו אופטימיזציה לכן קיבוע שגרתית ושעווה הטמעת פרוטוקולי להגדיל את המדגם השמירה. שמירה על המדגם על מצע הגידול שלה, שכיסה את המושבה עם אגר מייד לפני קיבוע מבטיחה כי המדגם אינו אבוד מהחלק העליון או הבסיס. עם זאת, שכיסה מושבות עם אגר זה חם מדי עלולה לגרום נזק המושבות, ולכן יש לנקוט משנה זהירות במהלך שלב זה.
קיבוע שלב קריטי עבור מבנה דרך התייבשות קשה, ניקוי, שמירה, הסתננות השלבים הנדרשים להטבעת פרפין. מצאנו באותו קיבעון ליזין-פורמלדהיד הכי טוב שומר על השלמות של המדגם. ליזין מסיסים, diamine ב, יכול להגיב עם aldehydes כדי ליצור פולימרים צולבים, הוצע לחזק את החומר exopolymeric (EPS) נגד השפלה מכני17,18.
הבחנו כי הרקע פלורסצנטיות יורדת עם רצופים שוטף את הסוכן ניקוי על בסיס שמן תפוז, או באמצעות חשיפה ממושכת, במהלך מדגם התייבשות (שלב 9.3). טיפול יתר עם הסוכן ניקוי יכול, עם זאת, לגרום דגימות שבירות שקשה סעיף19. יתכן צורך להתאים את אמצעי האחסון או את מספר שוטף כדי לשקף את הסכום של שעווה נוכח במהלך כל התייבשות. קרינה פלואורסצנטית רקע מוגבר יכול לנבוע גם זיהום של הרקמה עיבוד ריאגנטים, איפה השעווה, וזה קצת autofluorescent, באופן מלא או באופן חלקי miscible ניקוי ממיס או אתנול בשימוש השלבים (שלבים 6.1-6.4). בנוסף, מצאנו כי אתנול פוחתת כתב אות, זה קריטי להוות מחדש את fluorophore בעוד שני שוטף ל- PBS לפני הרכבה (שלב 9.5-9.6).
שיטה זו מאפשרת גם עבור הלוקליזציה של קרינה פלואורסצנטית מכוננת ומונהג על-ידי יזם ברזולוציה של תאים. עם זאת, אנו מייעצים זהירות כאשר משתמשים בשיטה זו כדי לפרש ביטוי גנים. הצעד כיסוי הציג את פרוטוקול זה (שלב 4.2), חלה לפני קיבוע ב 50 הלעפה תרוטרפמט, מציג שינוי סביבתי ניכר ביחס לתנאי הגידול הראשוני שעשוי להשפיע על דפוסי ביטוי גנים. זה עשוי להיות שימושי לאמת דפוסי ביטוי על-ידי החלת מקבע למושבה ישירות, מייד לפני מזיגת הכיסוי, אבל עם עלות מורפולוגיה (שלב אופציונלי 3.1-3.3).
גורם נוסף המשפיע את הפרשנות של קרינה פלואורסצנטית הוא הטופוגרפיה של הסעיף עצמו. אזורים שונים של biofilm עשויים להפגין בדרגות שונות של שלמות מבנית, להיות פחות או יותר מקובל שימור דרך קיבעון, בהתאם, אם בכלל, קבוצות פונקציונליות רכיבים אלה הם מסוגלים לתרום מקבע cross-linking 20. כתוצאה מכך, סעיפים עלולים לאבד ביומסה פרופורציה מהמשטח סעיף כאשר משתנה מאזור מורפולוגיים או מטבוליות אחד למשנהו לאורך ציר z של המושבה. זה יכול להתבצע על ידי הדמיה פרוסה מוקד שלם של המקטע עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
בנוסף להחלה טכניקה זו זנים מהונדסים חלבונים אקספרס הניאון, בחנו תכונות micromorphological על-ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) ועל בדגימות biofilm צבעונית עם צבעי פלורסנט ספציפיים (איור 3A ). ג'נינגס. ואח תיאר לאחרונה צבע ספציפי עבור פל, רב-סוכר העיקרי המיוצר על ידי biofilms פ aeruginosa PA14 21. כפי שמתואר התוצאות. פרוטוקול ונציג לעיל, היישום של זה צבע למקטעי מאפשר הדמיה של הפצה פל PA14 biofilms המושבה ברזולוציה גבוהה (איור 3C) 3. לעומת זאת, צבעי פלורסנט כגון אדום קונגו עשויים להתווסף מדיום הגידול, עם תמונה פוסט-אופטים (איור 3B). היישום של כיסוי גם שומר המושבה biofilm מבנה התא ומורפולוגיה במהלך עיבוד עבור TEM (איור תלת-ממד).
שיטת אופטימיזציה המתוארים כאן מאפשרת ההכנה של המושבה biofilms חלוקתה באמצעות הטבעה פרפין, שבה האות אנדוגני, תכונות או צבעי ומורכבת עשוי להיות מותאם ויוו עם רזולוציה מעולה תוך מזעור מדגם המושבה יליד מאקרו - ו מיקרו-מורפולוגיות אובדן ושימור. אנו להכיר כי מאמץ ניכר, זמן ושימוש ריאגנט נדרשים עבור שיטה זו. עם זאת, אנחנו מרגישים שאת החסרונות האלה הם להגיב על-פי מידת של שימור מורפולוגי, הרזולוציה של זריחה בבאתרו את amenability קדם ושגרות שלאחר ההגדלה או אסטרטגיות עיבוד חלופיות (כגון הכנה TEM) המוענקת על ידי שיטה זו.

רוב החיידקים יש את היכולת ליצור biofilms, קהילות של תאים מחוזק ע י מטריצות מתוצרת עצמית. ניתן לגדל Biofilms בסוגים רבים של כיוונונים פיזית, עם משטרים שונים של הוראה התזונתי, המצע. מבחני ספציפי עבור ביופילמים נוטים להניב מבנים multicellular לשחזור, ואת לארכיטקטורות נפוצות שנצפו phylogenetically מגוון מינים הקהילה או ברמה מאקרוסקופית. כאשר חיידקים גדלים כמו מושבות בינוני מוצק תחת אווירה, מורפולוגיה מאקרוסקופית מוסרת מידע אודות היכולת לייצור מטריקס, לעיתים קרובות עולה בקנה אחד עם אחרים תכונות 1,2,3. הארכיטקטורה הפנימית של מושבות חיידקים יכולים גם לספק רמזים לגבי כימיה biofilm ספציפיים, פיזיולוגיה, אבל היה קשה לאפיין. היישומים האחרונים של טכניקות cryoembedding ו- cryosectioning למושבות חיידקים אפשרו הדמיה והדמיה של תכונות ספציפיות החלטה חסרת תקדים 4,5,6. עם זאת, מחקרים ברקמות בעלי חיים הראו כי פרפין הטבעה ומוצריה מעולה של מורפולוגיה בהשוואה cryoembedding 7 שימש כדי להמחיש חיידקים רקמות 8,9. לכן פיתחנו פרוטוקול קיבוע, פרפין הטבעה של דק חלוקתה של מושבת חיידקים biofilms. כאן, אנו נתאר את הכנת Pseudomonas aeruginosa PA14 המושבה-biofilm דק סעיפים 10,11, אבל אנחנו גם בהצלחה החלת טכניקה זו biofilms הנוצרת על-ידי החיידק Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, ו ויבריו cholerae12.
התהליך של הטמעה-פרפין, דק-חלוקתה biofilms עוקב אחר פשוט הגיון. ראשית, biofilms עטוף בשכבה של אגר לשמר מורפולוגיה במהלך העיבוד. שנית, עטוף-biofilms טובע לשבועיים כדי crosslink מקרומולקולות, לשמר את micromorphology. אלה מכן מיובש עם אלכוהול, פינה עם הממס יותר לא קוטביים הינם הסתננו ואז עם פרפין נוזלי. לאחר שחדר, הדגימות מוטבעים לגושי שעווה על חלוקתה. סעיפים לחתוך, רכוב על שקופיות, ואז ולמיומנות כדי להחזיר אותם למצב יותר מקורי. מנקודה זו, ניתן צבעונית או מכוסה הרכבה בינונית לבדיקה מיקרוסקופית.
פרוטוקול זה מייצר חלקים דקים של חיידקים פתוגנים המועברים במזון מתאים לבדיקה היסטולוגית. המושבה biofilm substructures גלויים כאשר סעיפים דקים שהוכן בשיטה זו הם צילמו על ידי מיקרוסקופ אור. Biofilms יכול להיות גם גדל על כתמי פלורסנט המכיל מדיה ספציפיים עבור תכונות בודדות או צבעונית בשלב התייבשות, מייד לפני הרכבה (שלבים 9.5-9.6). לבסוף, ניתן לתכנן חיידקים כדי לייצר חלבונים פלורסנט אופנה מכוננת או מוסדר ומאפשר בחיי עיר הדיווח של התא הפצה או גנים ביטוי בתוך קהילות אלה. השתמשנו בשיטות אלה כדי לקבוע המושבה biofilm עומק תא הפצה, הפצה מטריקס, דפוסי הצמיחה, ייתכן גנים.

<table><tbody><tr><td>5 3/4&quot; Pasteur pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agar&amp;nbsp;</td><td>Teknova&amp;nbsp;</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr><td>Buchner Aspirator (Vacuum) Flask&amp;nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chemically-resistant Marking Pen</td><td>VWR</td><td>103051-182</td><td>Manufacturer: Leica</td></tr><tr><td>Clear Fingernail Polish&amp;nbsp;</td><td>********</td><td>********</td><td>Store bought</td></tr><tr><td>Congo Red Indicator Grade</td><td>VWR</td><td>AAAB24310-14</td><td>Manufacturer: Alfa Aesar</td></tr><tr><td>Coomassie Blue&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>EM-3340</td><td>Manufacturer: EMD Millipore</td></tr><tr><td>TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 247 04</td><td>Manufacturer: Electron Microscopy Sciences</td></tr><tr><td>Embedding Mold&amp;nbsp;</td><td>********</td><td>********</td><td>3D printed in-house</td></tr><tr><td>Embedding Mold (commercial)&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200P</td><td>Decon Labs, Inc.&amp;nbsp;</td><td>2701</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine-tipped Brush</td><td>********</td><td>********</td><td>Store bought, paint brush</td></tr><tr><td>Glass Coverslips 60x22mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-519-21C</td><td></td></tr><tr><td>Glass Rehydration Mailer&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>21043</td><td>20 slide mailer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histoclear-II, orange oil-based clearing agent&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 899 90150</td><td>Manufacturer: National Diagnostics&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histosette, Embedding Casette</td><td>Fisher Scientific</td><td>15 182 701A</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP386 100</td><td></td></tr><tr><td>Low Profile Microtome Blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>22 210 048</td><td>Manufacturer: Sturkey&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micropipette&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89080-004</td><td>Promo-pack</td></tr><tr><td>Micropipette Tips&amp;nbsp;</td><td>See comments section</td><td>See comments section</td><td>p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)</td></tr><tr><td>Microtome&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>905200U/00016050</td><td>Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050</td></tr><tr><td>Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin)</td><td>Ricca Chemical</td><td>RSOF0010-500A</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Xtra (paraffin wax)</td><td>VWR</td><td>15159-486</td><td>Manufacturer: McCormick Scientific&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Petri Dishes Square 100x100x15mm</td><td>Laboratory Disposable Products&amp;nbsp;</td><td>D210-16</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>EMD Chemicals&amp;nbsp;</td><td>PX1405-1</td><td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Potassium phosphate&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P380-500</td><td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Razor Blades&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Slide Warmer&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0865259</td><td>NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D</td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>0241-1KG</td><td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium phosphate&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH9296.500</td><td>,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Suprafrost Histology Slides&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Flotation Water Bath&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0815797</td><td>Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B</td></tr><tr><td>Automatic Tissue Processor&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>813160U/Q#00009061</td><td>Model: STP120 Tissue Processor</td></tr><tr><td>Tryptone&amp;nbsp;</td><td>Teknova&amp;nbsp;</td><td>T9012</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Teknova&amp;nbsp;</td><td>Y9010</td><td></td></tr></tbody></table>

paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis

חלוקתה באמצעות הטבעה פרפין היא טכניקה הוקמה באופן כללי במערכות האיקריוטים. כאן, אנו מספקים שיטה הקיבעון, הטבעה, ואת חלוקתה של biofilms בשלמותם המושבה חיידקים באמצעות perfused פרפין. להתאים שיטה זו לשימוש על המושבה biofilms, אנחנו פיתח טכניקות לשמירה על כל דגימה על מצע הגידול שלה, למינציה זה עם overlayer אגר, נוספו ליזין הפתרון מקבע. אלה אופטימיזציות לשפר את שימור הדגימה של שימור תכונות micromorphological. דוגמאות שהוכנו באופן זה נתונות דק חלוקתה והדמיה באמצעות מיקרוסקופ אור, זריחה, שידור. אנחנו החלת טכניקה זו המושבה biofilms של Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis ויבריו cholerae. רמה גבוהה של פירוט הגלויות בדגימות שנוצר על ידי שיטה זו, בשילוב עם זן כתבת הנדסה או השימוש של צבע ספציפי, יכול לספק תובנות מרגש הפיזיולוגיה והפיתוח של קהילות מיקרוביאלי.

שיטה זו יוצרת biofilm דק-סעיפים שבה תכונות מורפולוגיות שונות ואזורי גנים יכולים לדימות על ידי DIC, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות, TEM. בעוד DIC הדמיה באמצעות 40 X שמן טבילה המטרה יכול להיות מספיק כדי להראות כמה תכונות מורפולוגיות (איור 2E), מצאנו כי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה של זנים מתוכנן חלבון פלואורסצנטי צורונים אקספרס מספקת משופרת ויזואליזציה של התפלגות התא בתוך המדגם (איור דו-ממדי). תמונות של מקטעים בודדים ניתן להשתמש ביריעות ליצירת חתך רוחב של המושבה כולה (איור 2B), כדי לספק הקשר עבור ההתאמה של תכונות מבניות בתוך המבנה הכללי ברמה מאקרוסקופית (השווה איור 2A, B, ו- C). תכוניות מורפולוגיות, אותות פלואורסצנט ניתן למדוד באמצעות תוכנת הדמיה14. מבנים בתוך biofilm או מעברים בין אזורי גנים ואז ישויך עם הפצות של מטבוליטים או מעברי צבע כימי11 .
פרוטוקול זה יכול להיות מתוקן ומותאמים במספר דרכים. שימוש זן מתוכנן חלבון פלואורסצנטי אקספרס תחת השליטה של מקדם מכירות מסוים מאפשר הדמיה של ההתפלגות של ביטוי גנים (איור 3 א). ניתן לגדל מושבות באמצעי המכיל צבעים, או צבעים ניתן להוסיף פוסט-חלוקתה, כתם סוכרים מסוימים (דמויות 3B ו- C). לבסוף, דגימות המבושלות גירסה שונה של פרוטוקול זה יכול להיבדק על ידי TEM (איור 3D) כדי לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר מאשר זה מופעל על-ידי DIC או קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57196/57196fig1.jpg"> איור 1: מפרטים טכניים המתארים ההתקנה לצמיחה המושבה לפני קיבוע. (א) מושבות גדלים על גבי שתי שכבות של מדיום הגידול פני השטח-למוצק אגר (העליון והתחתון), (ב) הערוכים בשכבות ואז שכבה חדשה (שכבת-על), השומרת את המושבה מורפולוגיה. (ג) המושבה דחוקה בין שכבת-על השכבה העליונה ואז מופרדת מן השכבה התחתונה עיבוד נוסף. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57196/57196fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57196/57196fig2.jpg"> איור 2: Micromorphological ותכונות YFP פלורסצנטיות, חתכי רוחב של מושבות פרפין-מוטבע. נציג נתונים עבור Pseudomonas aeruginosa PA14 Δphz המושבה15 צורונים לבטא YFP גדל במשך 3 ימים ב- 1% טריפטון, אגר 1% המכיל Coomassie, קונגו אדום כחול. (א) להציג העליונה, קרינה פלואורסצנטית תמונת מראה חצי מושבה לפני קיבוע. (ב) חתך רוחב של המושבה כולה לאחר הטמעת פרפין. האזור מסגרת צולמה עם עדשה המטרה X 10 (ג). אזור מסגרת ב (ג) היה אז עם תמונה עם 40 X עדשה המטרה של טבילה שמן באמצעות קרינה פלואורסצנטית (ד) ו- DIC (E). סולם העמודות מייצגות 2 מ מ (א), 500 מיקרומטר (B) ו- 100 מיקרומטר (ג-ה). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57196/57196fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57196/57196fig3.jpg"> איור 3: כתב ביטוי, מראש, שלאחר ההגדלה של תכונות biofilm, TEM הדמיה של המושבה פרפין-מוטבע biofilm דגימות. (א) mexGPr-GFP כתב קרינה פלואורסצנטית במושבה aeruginosa פ PA14 גדל במשך 3 ימים על טריפטון 1%, 1% אגר. (ב) זריחה קונגו מאוגד, באדום מושבה synxantha פ גדל במשך 5 ימים על מדיום המכיל לצבוע. (ג) זריחה של הכתם לקטין ויסטריה floribunda עבור רב-סוכר פל במושבה aeruginosa פ PA14 Δphz (גדל במשך יומיים על טריפטון 1%, 1% אגר המכיל קונגו אדום ו Coomassie כחול), להחיל לאחר חלוקתה. (ד) TEM תמונה של מושבה Δ aeruginosa פ PA14phz (גדל במשך 3 ימים ב- 1% טריפטון, אגר 1% המכיל Coomassie, קונגו אדום כחול), ומעובדים על חלוקתה באמצעות הטבעה פרפין *. סרגל קנה מידה מייצג 40 µm (A-B), 20 מיקרומטר (ג) ו- 5 מיקרומטר (D). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57196/57196fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
* דוגמה זו היה מעובד עבור חלוקתה באמצעות הטבעה פרפין דרך בשלב 4 של פרוטוקול לעיל, תוך השמטת צעדים 4.1-4.3, ומעובד מכן בנפרד לניתוח TEM.

Watch this Scientific Journal Video about Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis at JoVE.com

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

פרפין הטבעה ואת חלוקתה דק של מושבת חיידקים Biofilms לבדיקה מיקרוסקופית

אנו מתארים קיבעון, פרפין הטבעה וטכניקות דק אופטים עבור biofilms מושבת חיידקים. בדגימות מוכן, דפוסי ביטוי בתיוג וכתבת biofilm ניתן לאבחן באמצעות מיקרוסקופ.

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

paraffin-embedding-thin-sectioning-microbial-colony-biofilms-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.2K Views.  Columbia University. אנו מתארים קיבעון, פרפין הטבעה וטכניקות דק אופטים עבור biofilms מושבת חיידקים. בדגימות מוכן, דפוסי ביטוי בתיוג וכתבת biofilm ניתן לאבחן באמצעות מיקרוסקופ.

Video: Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin sections of the specimen. Although preparing serial ultrathin sections is considered to be very difficult, it is rather easy if the proper method is used. In this paper, we show a step-by-step procedure for safely obtaining serial ultrathin sections of microorganisms. The key points of this method are: 1) to use the large part of the specimen and adjust the specimen surface and knife edge so that they are parallel to each other; 2) to cut serial sections in groups and avoid difficulty in separating sections using a pair of hair strands when retrieving a group of serial sections onto the slit grids; 3) to use a 'Section-holding loop' and avoid mixing up the order of the section groups; 4) to use a 'Water-surface-raising loop' and make sure the sections are positioned on the apex of the water and that they touch the grid first, in order to place them in the desired position on the grids; 5) to use the support film on an aluminum rack and make it easier to recover the sections on the grids and to avoid wrinkling of the support film; and 6) to use a staining tube and avoid accidentally breaking the support films with tweezers. This new method enables obtaining serial ultrathin sections without difficulty. The method makes it possible to analyze cell structures of microorganisms at high resolution in 3D, which cannot be achieved by using the automatic tape-collecting ultramicrotome method and serial block-face or focused ion beam scanning electron microscopy.

This study presents reliable and easy procedures for obtaining serial ultrathin sections of a microorganism without expensive equipment in transmission electron microscopy.

שיטה להשגת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים במשחק במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

Engineering

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

במושבה שמרים והטבעה שיטה

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Biology

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

נוקשה ההטמעה של קבוע, צבעונית, ככלל, דגימות מילימטר-סולם עבור היסטולוגיה ללא סעיף תלת-ממד על-ידי מיקרו-שחושב טומוגרפיה

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Bioengineering

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

טכניקות מיקרוסקופיה לפענוח התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים מיקוהטרוטרופיים ונביטה סימביוטית של זרעים

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Histological Sample Preparation for Light Microscopy

Histology is the study of cells and tissues, which is typically aided by the use of a light microscope. The preparation of histological samples can vary greatly based on the inherent properties of the samples such as size and hardness as well as expected post-processing which includes planned staining techniques or other down-stream applications. As described in this video, specimen preparation typically begins with a fixation procedure to prevent degradation of the sample by naturally occurring enzymes that are released by the cells upon death. Once fixed, samples are placed into an embedding medium that is able to sufficiently support the sample. Most commonly this is paraffin wax, but other materials such as a glycerin based freezing medium and agars are also used to surround the sample during sectioning. Sectioning then takes place on a microtome or other cutting device that allows the user to shave the sample into thin slices ranging from a few microns to a few millimeters in thickness. Once cut, sections are mounted on a glass slide and stained to bring out specific features of the sample before being imaged on a microscope.

Histological Sample Prep for a Light Microscope

הכנת מדגם היסתולוגי למיקרוסקופיה קלה

Histology is the study of cells and tissues, which is typically aided by the use of a light microscope.  The preparation of histological samples can vary ...

Education

JoVE Science Education

Basic Biology

General Laboratory Techniques

Formalin-Fixed Paraffin Embedded (FFPE) Tissue Preservation: A Method for Studying Tissue Morphology

Source: Nagaraj A.S., et al., <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58569/establishment-analysis-tumor-slice-explants-as-prerequisite-for">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The following video describes how to preserve morphology of a tissue with formalin fixation and paraffin embedding.

שימור רקמות משובצות פרפין קבוע פורמלין (FFPE): שיטה לחקר מורפולוגיה של רקמות

Source: Nagaraj A.S., et al., Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. J. Vis. Exp. (2018)
The ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancer Research

Lung Cancer

Ex vivo study

A Method for Sample Preparation to Visualize Biofilm Forming Bacteria on Fungal Hyphae

Source: Guennoc, Cora Miquel, et al, <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54771">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video describes a method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae using microscopy. Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and involve numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation.

שיטה להכנת דגימות כדי לדמיין חיידקים יוצרי ביופילם על קורים פטרייתיים

1. Preparation of an In Vitro Biofilm of Bacteria on the Fungal Colony

	Centrifuge the bacterial culture at 5,000 x g for 3 min and suspend the pellet in ...

Immunology

Immunodiagnostics

In Vitro and In Vivo Models

Fixation and Sectioning

Two basic types of preparation are used to visualize specimens with a light microscope: wet mounts and fixed specimens.
The simplest type of preparation is the wet mount, in which the specimen is placed in a drop of liquid on the slide. A liquid specimen can be directly deposited on the slide using a dropper. Solid specimens, such as skin scraping, can be placed on the slide before adding a drop of liquid to prepare the wet mount. Sometimes the liquid is simply water, but stains are often added to enhance contrast. Once the liquid has been added to the slide, a coverslip is placed on top, and the specimen is ready for examination under the microscope.
The second method of preparing specimens for light microscopy is fixation. The &#8220;fixing&#8221; of a sample refers to the process of attaching cells to a slide. Fixation is often achieved by heating (heat fixing) or chemically treating the specimen. In addition to attaching the specimen to the slide, fixation also kills microorganisms in the specimen, stopping their movement and metabolism while preserving the integrity of their cellular components for observation.
To heat-fix a sample, a thin layer of the specimen is spread on the slide (called a smear), and the slide is then briefly heated over a heat source. Chemical fixatives are often preferable to heat for tissue specimens. Chemical agents such as acetic acid, ethanol, methanol, formaldehyde (formalin), and glutaraldehyde can denature proteins, stop biochemical reactions, and stabilize cell structures in tissue samples.
In addition to fixation, staining is almost always applied to color certain features of a specimen before examining it under a light microscope. Stains, or dyes, contain salts made up of a positive ion and a negative ion. Depending on the type of dye, the positive or the negative ion may be the chromophore (the colored ion); and the other uncolored ion is called the counterion. If the chromophore is the positively charged ion, the stain is classified as a basic dye; if the negative ion is the chromophore, the stain is considered an acidic dye.
Dyes are selected for staining based on the chemical properties of the dye and the specimen being observed, which determine how the dye will interact with the specimen. In most cases, it is preferable to use a positive stain, a dye that will be absorbed by the cells or organisms being observed, adding color to objects of interest to make them stand out against the background. However, there are scenarios where it is advantageous to use a negative stain absorbed by the background but not by the cells or organisms in the specimen. Negative staining produces an outline or silhouette of the organisms against a colorful background.
Because cells typically have negatively charged cell walls, the positive chromophores in basic dyes tend to stick to the cell walls, making them positive stains. Thus, basic dyes such as basic fuchsin, crystal violet, malachite green, methylene blue, and safranin typically serve as positive stains. On the other hand, the negatively charged chromophores in acidic dyes are repelled by negatively charged cell walls, making them negative stains. Commonly used acidic dyes include acid fuchsin, eosin, and rose bengal.
Some staining techniques involve the application of only one dye to the sample; others require more than one dye. In simple staining, a single dye is used to emphasize particular structures in the specimen. A simple stain will generally make all of the organisms in a sample appear the same color, even if the sample contains more than one type of organism. In contrast, differential staining distinguishes organisms based on their interactions with multiple stains. In other words, two organisms in a differentially stained sample may appear different colors. Differential staining techniques commonly used in clinical settings include Gram staining, acid-fast staining, endospore staining, flagella staining, and capsule staining.
This text is adapted from <a href="https://openstax.org/books/microbiology/pages/2-4-staining-microscopic-specimens">Openstax, Microbiology 2e, Section 2.4: </a><a href="https://openstax.org/books/microbiology/pages/2-4-staining-microscopic-specimens">Staining microscopic specimens</a>

קיבוע וחתך

Two basic types of preparation are used to visualize specimens with a light microscope: wet mounts and fixed specimens.
The simplest type of preparation ...