Name: paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis
Uploaded: 2018-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von NSF-Karriere-AWARD-1553023 und NIH/NIAID Award R01AI103369 unterstützt.

1. Wachstum von Pseudomonas Aeruginosa Biofilms Kolonie
<ol><li>Vorbereitung der Medium-Bilayer Platten<ol>
<li>Bereiten Sie eine Tryptone von 10 g/L, 10 g/L Agar (siehe Tabelle der Materialien) Lösung in entionisiertem Wasser.</li>
		<li>Autoklaven für 20 min. Abkühlen auf 50-60 ° C in einem Wasserbad.</li>
		<li>45 mL der Agar-Tryptone-Lösung in ein 100 x 100 mm quadratische Schale gießen (siehe Tabelle der Materialien) mit einem 50 mL konische Rohr. Ermöglichen das Agar zu festigen (~ 20-30 min). Gießen Sie eine zweite, 15 mL Schicht auf die erste Schicht. Über Nacht erstarren lassen, Deckel entfernen Kondenswasser aus ggf. durch mit einem fusselfreien Tuch abwischen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spotting Kolonie Biofilme<ol>
<li>Streifen Sie die Stämme von Interesse aus den Beständen der Gefrierschrank auf LB-Agar-Platten-13 und inkubieren Sie im Dunkeln für 12-16 h bei 37 ° C und 80-100 % Relative Luftfeuchtigkeit.</li>
		<li>Können Sie für jede Sorte oder replizieren eine einzelne Kolonie impfen 2 mL LB und im Dunkeln für 12-16 h bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 u/min inkubieren.</li>
		<li>Sub-Kultur durch eine Verdünnung von 1: 100 in frisches LB und im Dunkeln für 2,5-3 h bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 u/min Inkubation.</li>
		<li>Optische Dichte mit einem Spektralphotometer messen und justieren Sie mit sterilen LB eine Zellsuspension mit einer OD zu erreichen500 nm von ~ 0,5.</li>
		<li>Abhängig von der gewünschten Kolonie Größe, Pipettieren 2,5-10 µL Zellsuspension auf einem Medium-Bilayer Teller (vorbereitet in Schritt 1.1) und erlauben Ort trocknen für ~ 20 min. verlassen die Petri-Deckel einen Spalt offen, in der Nähe einer offenen Flamme trocknen erleichtern können.</li>
		<li>Inkubieren Sie vor Ort Kolonien bei 25 ° C und 80-100 % Relative Luftfeuchtigkeit, im Dunkeln für bis zu 4 Tage.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Zubereitung der Fixativ
<ol><li>Bereiten Sie die Fixativ Lösung am Tag der Ernte Probe. Verdünnen Sie 37 % Formaldehyd (FA) mit 1 X PBS-Puffer auf eine Endkonzentration von 4 % FA. Achtung: FA ist flüchtig und giftig. Schutzausrüstung tragen und arbeiten in einem gut gelüfteten Abzug.</li>
	<li>Unmittelbar vor der Anwendung, L-Lysin-Hydrochlorid in 4 % auflösen FA (vorbereitet in Schritt 2.1) bei Raumtemperatur, eine Endkonzentration von 50 mM L-Lysin HCl.</li>
</ol>3. direkte Anwendung Fixativ auf der Kolonie Biofilm [Optional]
Hinweis: Wir haben festgestellt, dass Biofilm Morphologie ist am besten erhalten, wenn das Agar-Overlay vor Fixierung hinzugefügt wird. Allerdings ist dieser Schritt auch eine Änderung der Umweltbedingungen, die Genexpression beeinflussen könnten. Fluoreszierende Reporter Expressionsmuster sollte daher überprüft werden, mit einem besonderen Protokoll, in dem die Fixierung Schritt vor der Zugabe der Overlay-Agar, durchgeführt wird, wie hier beschrieben.
<ol><li>Am Tag der Aufzeichnung, und arbeiten in einem gut gelüfteten Abzug pipette das Fixiermittel vorbereitet in Schritt 2 direkt auf die Agar-Oberfläche um die Kolonie Rand, so dass es zu der Kolonie Peripherie zu erreichen, ohne eintauchen. Gelten Sie nur wie viel Fixiermittel wie voll ist erforderlich, um die Kolonie umgeben, ca. 500 µL. ermöglichen das Fixiermittel in der Kolonie und den umliegenden Agar verbreiten.</li>
	<li>Sobald das Fixiermittel vollständig absorbiert in die Kolonie und umgebenden Medien, ca. 20-30 min wurde, und passives FA nicht mehr sichtbar auf dem Teller ist, wiederholen Sie Schritt 3.1. Lassen Sie das Fixiermittel in der Kolonie und den umliegenden Agar verbreiten.</li>
	<li>Sobald das Fixiermittel vollständig absorbiert in die Kolonie wurde und umgebende Medien wiederholen Sie Schritt 3.1, diesmal direkt die Oberfläche der Kolonie Fixiermittel zuweisen. Diese Fixiermittel in der Kolonie und den umliegenden Agar verbreiten lassen, weiter zu Schritt 4 nur nachdem alle Fixativ wurde aufgenommen und ist nicht mehr sichtbar auf dem Teller.</li>
</ol>4. überstehende Kolonien mit Agar
<ol><li>Am Tag der Fixierung bereiten Sie ein 10 g/L Agar Lösung in entionisiertem Wasser und Autoklaven für 10-20 Minuten zu lösen. In einem Wasserbad auf 50 ° c abkühlen.</li>
	<li>Übergießen Sie 15 mL der Lösung Agar sanft das Wachstumsmedium und Kolonie. Ermöglichen der Agar, ein Gel bei Raumtemperatur für 5 min (Abbildung 1 b) zu bilden.</li>
	<li>Verwenden Sie eine scharfe Rasierklinge, schneiden Sie ein Quadrat, 3-lagig Futter mit der Kolonie zwischen den oberen beiden Schichten laminiert. Wenn mehrere Proben vorbereiten, sicherzustellen Sie, dass jedes Futter auf eine vergleichbare Größe geschnitten wird.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Agar aus der Kolonie-haltigen Futter.</li>
	<li>Um die beiden oberen Schichten des Nährbodens (mit der Kolonie) Weg von der Unterschicht des Futters (Abbildung 1) zu heben, den flachen Kopf einer Spachtel in 1 x PBS oder Wasser nass und sanft zwischen den oberen und unteren Schichten einfügen. Die laminierte Kolonie sollte die Unterschicht trennen. Achten Sie darauf, nicht zu verfälschen oder die laminierte Kolonie zu biegen, wenn es von seinem Sockel heben.</li>
</ol>5. Fixierung
<ol><li>Arbeiten in einem gut gelüfteten Abzug sofort die laminierte Kolonie (d. h. 2-lagige Chuck) in einer Einbettung Kassette übertragen (siehe Tabelle der Materialien), gekennzeichnet mit einem chemikalienbeständigen Markierstift. Legen Sie die einbettende Kassette in ein Glas-Folie-Mailer (siehe Tabelle der Materialien), enthält das Fixiermittel in Schritte 2.1-2.2 vorbereitet. Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen in der einbettenden Kassette gefangen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe im Fixiermittel über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur.</li>
</ol>6. Probenverarbeitung: Puffer waschen, Austrocknung, Clearing und Infiltration
<ol><li>Waschen Sie nach der Übernachtung Fixierung die Probe zweimal mit 1 X PBS-Puffer für 1 h. Die besten Ergebnisse zu automatisieren Reagenz Homogenisierung mit dem Spin Funktion eines automatischen Gewebe-Prozessors (siehe Tabelle der Materialien) auf einer niedrigen Einstellung eingestellt. Wenn kein Prozessor verfügbar ist, kann die Verarbeitung manuell ausgeführt werden.</li>
	<li>Folgen Sie das Puffer waschen durch Wasserentzug durch eine abgestufte Reihe von Ethanol (EtOH) Verdünnungen mit 1 X PBS-Puffer (25 %, 50 %, 70 %, 95 %) für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entwässern in drei wäscht von 100 % EtOH für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Deutlich dehydrierte Probe in drei wäscht von 100 % orange Öl basierenden Clearing Agent (siehe Tabelle der Materialien) für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Infiltrieren die geräumte Stichprobe zweimal mit geschmolzenem Paraffin Wachs (siehe Tabelle der Materialien), beheizt bis 55˚C, 2 h.</li>
</ol>7. Probe einbetten
<ol><li>Füllen Sie ein Wachs Schimmel mit flüssigem Paraffin Wachs auf 55 ° c erhitzt. Mit einem Spatel beheizten, flache schnell übertragen das eingedrungene Futter aus der Einbettung Kassette in die Wachs-Form, um sicherzustellen, dass das Futter Parallel zur Grundfläche des Schimmels liegt. Vermeiden Sie übermäßigen Druck auf das Spannfutter. Wachs Formen können benutzerdefinierte 3-d gedruckt werden oder sind im Handel erhältlich (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Lassen Sie Wachs, über Nacht bei 4 ° c erstarren. Proben in feste Wachs geformt können auf unbestimmte Zeit bei 4 ° c gelagert werden.</li>
	<li>Sobald das Wachs erstarrt ist, Verbrauchsteuern Sie die Probe aus der Form und schneiden Sie überschüssiges Wachs aus um die Probe mit einer Rasierklinge. Überschüssiges Wachs erstreckt sich von einem Ende der Probe, parallel zur Ebene der Schnitt, die verwendet werden, um es in das Mikrotom Klemme zu verlassen (siehe Tabelle der Materialien). Auch eine Hülle aus Wachs, ca. 1 mm dick, um die Probe verlassen und seine Flächen zu glätten.</li>
</ol>8. Schneiden
<ol><li>Erhitzen Sie ein Wasserbad auf 42 ° c. Klemmen Sie die Probe in das Mikrotom mit der Oberfläche der Kolonie senkrecht orientiert sich an den Rand des Blattes (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Schneiden Sie die Probe in Intervallen von 50 µm, bis die gewünschte Ebene der Kolonie erreicht worden ist, aus denen Abschnitte erfasst werden.</li>
	<li>Schneiden Sie eine Band von die gewünschte Anzahl von 10 µm dicke Abschnitte mit einem Mikrotom legen Sie auf einer speziellen Geschwindigkeit von 75-80 u/min und einen Freiwinkel von 6-10˚. Verwenden Sie einen feinen Spitzen Pinsel, um das Band von der Klinge zu lösen.</li>
	<li>Übertragen Sie das Band mit einem Tropfen Wasser an der Spitze einer Pasteurpipette (bevorzugt) oder Zange, sanft auf das Wasserbad werden. Achten Sie darauf, um Trapping Luftblasen unter dem Abschnitt zu vermeiden.</li>
	<li>Sofort fügen Sie eine Folie in das Wasserbad und positionieren Sie es unterhalb des Menübands in einem Winkel von 45°.</li>
	<li>Tippen Sie auf den schmalen Rand der Multifunktionsleiste auf die Folie, knapp unterhalb der mattierten Label. Das Band sollte halten.</li>
	<li>Ziehen Sie die Folie aus dem Wasserbad, Einstellung des Winkels, senkrecht zur Oberfläche des Wassers zu werden, und ermöglicht das Band flach gegen die Folie entlang seiner Länge liegen. Zu vermeiden, überfüllen überschüssiges Wasser unterhalb der Multifunktionsleiste.</li>
	<li>Stehen Sie vorsichtig die Folie auf eine saugfähige fusselfreien Tuch, wicking überschüssiges Wasser aus dem Abschnitt.</li>
	<li>Legen Sie die Folie auf einem Papiertuch und bei Raumtemperatur über Nacht im Dunkeln trocknen lassen. Folien können auf unbestimmte Zeit bei 4 ° c im Dunkeln aufbewahrt werden.</li>
</ol>9. Hitze-Befestigung, Rehydratation und Montage
<ol><li>Erhitzen Sie eine flache Heizplatte auf 45 ° c. Erhitzen Sie die Folie für 30-60 min. Das Wachs wird halb geschmolzen werden und gegen die Folie glätten.</li>
	<li>Heben Sie die Folie von der heißen Platte und legen Sie ihn flach auf eine glatte, flache, Raumtemperatur-Oberfläche mit darauf achten, dass das geschmolzene Wachs ziehen nicht auf beiden Seiten der Folie, bis das Wachs erstarrt (~ 1 min).</li>
	<li>De-Wachs mit einem Glas-Folie-Mailer, Folien in vier Waschungen von clearing Agent für jeweils 5 min über eine Absauganlage Büchner Lösung zwischen den Waschgängen entfernen.</li>
	<li>Waschen Sie die Folien dreimal in 100 % EtOH für 1 min.</li>
	<li>Aktivieren Sie die Folien in einer abgestuften Reihe von Ethanol in der umgekehrten Reihenfolge der Bearbeitung (95 %, 70 %, 50 % und 25 %) für 1 min, jeweils gefolgt von zwei 1-min-Waschungen mit 1 X PBS-Puffer.</li>
	<li>Sofort die Abschnitte in ein Tris gepufferte Eindeckmedium montieren (siehe Tabelle der Materialien) und wenden Sie ein Deckglas, die Einführung von Luftblasen zu vermeiden. Eindeckmedium über Nacht bei Raumtemperatur polymerisieren zu ermöglichen.</li>
	<li>Sobald polymerisiert, versiegeln Sie das Deckglas auf der Folie mit klaren Nagellack. Versiegelte Folien können auf unbestimmte Zeit im Dunkeln bei 4 ° c gespeichert werden.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Einbetten von Paraffin und dünn schneiden Gewebeproben ist eine klassische histologische Technik, die ermöglicht die Abbildung von Mikro-morphologische Strukturen und wird häufig auf eukaryotischen Geweben verwendet und mit einigem Erfolg auf mikrobielle Proben8 angewendet wurde ,9. Während Cryoembedding für die starke Bindung des endogenen und immunofluorescent Signals ermöglicht, ist Paraffin einbetten generell vorzuziehen, da sie besseren Schutz der Morphologie16bietet. Bei der Anpassung dieser Methode für die Anwendung auf mikrobielle Biofilme, konzentrierten wir uns auf Eigenschaften, die einzigartig für unser System. Die Zellen und Matrix des Gewebes sind oft relativ robust zusammengehalten während Biofilme sind in der Regel empfindlicher; Wir haben daher Routine Fixierung und Wachs einbetten Protokolle zur Maximierung der Probe Aufbewahrung optimiert. Aufrechterhaltung der Probe auf seine Wachstumssubstrat und überlagern die Kolonie mit Agar unmittelbar vor der Fixierung sorgt dafür, dass die Probe nicht von oben oder von der Basis verloren geht. Jedoch schadet überlagern Kolonien mit Agar, das zu heiß ist die Kolonien also bei diesem Schritt darauf geachtet werden sollte.
Die Fixierung ist ein entscheidender Schritt für die Beibehaltung der Struktur durch die rauen Dehydrierung, clearing, und Infiltration Schritte erforderlich für das Paraffin einbetten. Wir fanden, dass Lysin-Formaldehyd-Fixierung am besten bewahrt die Integrität der Probe. Lösliche Lysin, einem Diamin reagiert mit Aldehyden, vernetzte Polymere zu bilden und Stärkung der Exopolymeric Substanz (EPS) gegen mechanische Abbau17,18vorgeschlagen wurde.
Wir haben beobachtet, dass Hintergrundfluoreszenz mit aufeinander folgenden Waschungen im orange Öl basierenden Clearing Agent oder über längere Zeit, während der Probe Rehydratation (Schritt 9.3) abnimmt. Über-Behandlung mit dem Clearing Agent führt jedoch zu spröde Proben, die schwer zu Abschnitt19. Es kann erforderlich sein, das Volumen oder Anzahl der Waschgänge entsprechend der Menge des Wachses während jeder Rehydratation anzupassen sein. Erhöhte Hintergrundfluoreszenz kann ebenso ergeben sich aus Verunreinigungen des Gewebes verarbeitet Reagenzien, wo das Wachs, das etwas Autofluorescent ist, ganz oder teilweise mischbar in der Lichtung Lösungsmittel oder Ethanol in diese Schritte (Schritte verwendet 6.1-6.4). Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass Ethanol Reporter Signal vermindert, und es kritisch ist zu der Fluorophor in zwei Waschungen von PBS vor der Montage (Schritt 9.5 9.6).
Diese Methode ermöglicht auch die Lokalisierung der konstitutiven und Projektträger-gesteuerte Fluoreszenz bei der Auflösung von Zellen. Jedoch raten wir zur Vorsicht bei Verwendung dieser Methode Genexpression zu interpretieren. Der Overlay-Schritt eingeführt, die in diesem Protokoll (Schritt 4.2), angewandte vor Fixierung bei 50 ° c, stellt eine erhebliche Veränderungen der Umwelt im Vergleich zu den ursprünglichen Wachstumsbedingungen, die gen-Expression-Muster beeinflussen können. Es möglicherweise nützlich, um Expressionsmuster überprüfen indem Fixiermittel in die Kolonie direkt, unmittelbar vor dem Gießen der Überlagerung, aber zu einem Preis auf Morphologie (optionaler Schritt 3.1-3.3).
Ein weiterer Einflussfaktor für die Interpretation der Fluoreszenz ist die Topographie des Abschnitts selbst. Verschiedenen Regionen des Biofilms weisen unterschiedliche Grade der strukturellen Integrität und werden mehr oder weniger offen für Erhaltung über Fixierung, je nach dem, können gegebenenfalls funktionelle Gruppen diese Komponenten sind in der Lage beitragen zur Fixativ Vernetzung 20. Infolgedessen Abschnitte verlieren Biomasse überproportional von der Sektion Oberfläche beim Übergang von einer morphologischen oder metabolische Zone zur anderen entlang der Kolonie z-Achse. Dies kann durch Bildgebung eine intakte fokale Scheibe des Abschnitts mit einem confocal Mikroskop behoben werden.
Neben der Anwendung dieser Technik zu Klängen entwickelt, um ausdrückliche fluoreszierende Proteine, haben wir mikromorphologischer Funktionen von Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) und im Biofilm Proben befleckt mit bestimmten Fluoreszenzfarbstoffen (Abbildung 3A geprüft ). Jennings Et Al. beschrieben vor kurzem einen bestimmten Farbstoff für Pel, die großen Polysaccharid von p. Aeruginosa PA14 Biofilme 21produziert. Wie im obigen Protokoll und Vertreter Ergebnisse beschrieben, ermöglicht die Anwendung von dieser Farbstoff Abschnitte zur Visualisierung der Pel-Verteilung in PA14 Kolonie Biofilmen in hoher Auflösung (Abbildung 3) 3. Umgekehrt, fluoreszierende Farbstoffe wie Kongo-rot zugesetzt werden, um das Wachstumsmedium und Post-Stationspunkte (Abb. 3 b) abgebildet. Die Anwendung einer Überlagerung schont Kolonie Biofilm Morphologie und Zelle Struktur in der gesamten Verarbeitung für TEM (Abbildung 3D).
Die hier beschriebene optimierte Methode ermöglicht die Vorbereitung der Kolonie Biofilmen auf Schnitt über Paraffin einbetten, wobei endogene Signal und Features oder komplexiert Farbstoffe sein kann lokalisiert in Vivo mit hervorragender Auflösung bei gleichzeitiger Minimierung der Probe Verlust und Erhalt native Kolonie Makro und Mikro-Morphologien. Wir anerkennen, dass erhebliche Mühe, Zeit und Reagenz Verwendung für diese Methode erforderlich. Wir denken jedoch, dass diese Nachteile durch den Grad der morphologischen Erhaltung, die Auflösung der Fluoreszenz in Situ und Hilfsbereitschaft, Pre- und Post-befleckenden Verfahren oder alternative Verarbeitungsstrategien (z. B. Vorbereitung begegnet sind TEM) durch diese Technik gewährte.

Die meisten Mikroben haben die Fähigkeit, Form Biofilme, zusammengehalten Gemeinschaften von Zellen durch selbst erstellte Matrizen. Biofilme können in vielen Arten von physischen Setups mit verschiedenen Regimen Nährstoff- und Substrat Bestimmung angebaut werden. Spezifischen Assays für die Biofilmbildung tendenziell reproduzierbare vielzellige Strukturen ergeben, und gemeinsame Architekturen für phylogenetisch Artenvielfalt auf der makroskopischen Ebene oder Gemeinschaft eingehalten werden. Wenn Mikroben als Kolonien auf festem Medium unter Atmosphäre gewachsen sind, makroskopische Morphologie vermittelt Informationen über die Kapazität für die Produktion von Matrix und oft korreliert mit anderen Eigenschaften 1,2,3. Die interne Architektur der mikrobiellen Kolonien liefern auch Hinweise auf Biofilm-spezifische Chemie und Physiologie, aber schwer zu charakterisieren. Aktuelle Anwendungen von Cryoembedding und Kryoschneiden Techniken zu Bakterienkolonien ermöglichten Bildgebung und Visualisierung von Besonderheiten in noch nie da gewesenen Auflösung 4,5,6. Studien mit tierischem Gewebe haben jedoch gezeigt, dass Paraffin einbetten bietet hervorragende Erhaltung der Morphologie im Vergleich zu Cryoembedding 7 und verwendet wurde, um Bakterien im Gewebe 8,9zu visualisieren. Deshalb haben wir ein Protokoll zur Fixierung, Paraffin einbetten und dünn schneiden von mikrobiellen Kolonie Biofilmen entwickelt. Hier beschreiben wir die Vorbereitung von Pseudomonas Aeruginosa PA14 Kolonie-Biofilm Dünnschliffe 10,11, aber wir haben diese Technik Biofilme bilden die Bakterien auch erfolgreich angewendet Pseudomonas Synxantha, Bacillus Subtilis, und Vibrio Cholerae12.
Der Prozess von Paraffin einbetten und dünn schneiden Biofilmen folgt einer einfachen Logik. Erstens sind die Biofilme in einer Schicht von Agar, Morphologie während der Verarbeitung zu bewahren umhüllt. Zweitens die eingehüllte Biofilme sind eingetaucht in ein Fixiermittel, Crosslink Makromoleküle und Mikromorphologie bewahren. Diese sind dann mit Alkohol dehydriert, mit einem nicht-polaren Lösungsmittel gelöscht und dann mit flüssigem Paraffin Wachs infiltriert. Sobald infiltriert, sind die Proben eingebettet in Wachs Blöcke für schneiden. Abschnitte sind geschnitten, montiert auf Folien und dann rehydriert um mehr nativen Zustand zurücksenden. Ab diesem Zeitpunkt können sie gebeizt oder in Eindeckmedium für die mikroskopische Analyse abgedeckt.
Dieses Protokoll produziert Dünnschliffe von mikrobiellen Biofilmen für histologische Analyse geeignet. Kolonie Biofilm Unterkonstruktionen sind sichtbar, wenn Dünnschliffe vorbereitet, mit dieser Methode durch Lichtmikroskopie abgebildet werden. Biofilme können auch auf Medien mit fluoreszierenden Flecken angebaut werden spezifisch für einzelne Features oder gebeizt Rehydratation Schritt unmittelbar vor der Montage (Schritte 9.5 9.6). Zu guter Letzt können Mikroben entwickelt werden, um fluoreszierende Proteine in einer konstitutiven oder regulierten Mode ermöglicht Berichten in Situ Zelle Verteilung oder Gen-Ausdrucks innerhalb dieser Gemeinschaften zu produzieren. Wir haben diese Methoden verwendet, um Kolonie Biofilm Tiefe, Zelle Verteilung Matrix Verteilung, Wachstumsmuster und raumzeitlichen Genexpression zu bestimmen.

<table><tbody><tr><td>5 3/4&quot; Pasteur pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agar&amp;nbsp;</td><td>Teknova&amp;nbsp;</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr><td>Buchner Aspirator (Vacuum) Flask&amp;nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chemically-resistant Marking Pen</td><td>VWR</td><td>103051-182</td><td>Manufacturer: Leica</td></tr><tr><td>Clear Fingernail Polish&amp;nbsp;</td><td>********</td><td>********</td><td>Store bought</td></tr><tr><td>Congo Red Indicator Grade</td><td>VWR</td><td>AAAB24310-14</td><td>Manufacturer: Alfa Aesar</td></tr><tr><td>Coomassie Blue&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>EM-3340</td><td>Manufacturer: EMD Millipore</td></tr><tr><td>TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 247 04</td><td>Manufacturer: Electron Microscopy Sciences</td></tr><tr><td>Embedding Mold&amp;nbsp;</td><td>********</td><td>********</td><td>3D printed in-house</td></tr><tr><td>Embedding Mold (commercial)&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200P</td><td>Decon Labs, Inc.&amp;nbsp;</td><td>2701</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine-tipped Brush</td><td>********</td><td>********</td><td>Store bought, paint brush</td></tr><tr><td>Glass Coverslips 60x22mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-519-21C</td><td></td></tr><tr><td>Glass Rehydration Mailer&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>21043</td><td>20 slide mailer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histoclear-II, orange oil-based clearing agent&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 899 90150</td><td>Manufacturer: National Diagnostics&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histosette, Embedding Casette</td><td>Fisher Scientific</td><td>15 182 701A</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP386 100</td><td></td></tr><tr><td>Low Profile Microtome Blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>22 210 048</td><td>Manufacturer: Sturkey&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micropipette&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89080-004</td><td>Promo-pack</td></tr><tr><td>Micropipette Tips&amp;nbsp;</td><td>See comments section</td><td>See comments section</td><td>p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)</td></tr><tr><td>Microtome&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>905200U/00016050</td><td>Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050</td></tr><tr><td>Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin)</td><td>Ricca Chemical</td><td>RSOF0010-500A</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Xtra (paraffin wax)</td><td>VWR</td><td>15159-486</td><td>Manufacturer: McCormick Scientific&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Petri Dishes Square 100x100x15mm</td><td>Laboratory Disposable Products&amp;nbsp;</td><td>D210-16</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>EMD Chemicals&amp;nbsp;</td><td>PX1405-1</td><td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Potassium phosphate&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P380-500</td><td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Razor Blades&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Slide Warmer&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0865259</td><td>NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D</td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>0241-1KG</td><td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium phosphate&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH9296.500</td><td>,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Suprafrost Histology Slides&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Flotation Water Bath&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0815797</td><td>Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B</td></tr><tr><td>Automatic Tissue Processor&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>813160U/Q#00009061</td><td>Model: STP120 Tissue Processor</td></tr><tr><td>Tryptone&amp;nbsp;</td><td>Teknova&amp;nbsp;</td><td>T9012</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Teknova&amp;nbsp;</td><td>Y9010</td><td></td></tr></tbody></table>

paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis

Über Paraffin einbetten-Schnitt ist eine weitgehend etablierte Methode in eukaryontischen Systemen. Hier bieten wir eine Methode zur Fixierung, einbetten und intakte mikrobielle Kolonie Biofilme mit perfundierten Paraffin-Wachs-Schnitt. Um diese Methode für den Einsatz auf Kolonie Biofilme anzupassen, wir entwickelten Techniken für die Pflege jedes Sample auf seine Wachstumssubstrat und mit einer Agar-Overlayer Laminieren und Lysin Fixativ Projektmappe hinzugefügt. Diese Optimierungen verbessern Probe Aufbewahrung und Erhaltung der mikromorphologischer Funktionen. Proben, die auf diese Weise zubereitet sind dünn schneiden und Bildgebung durch Licht, Fluoreszenz, und Transmissionselektronenmikroskopie zugänglich. Wir haben diese Technik auf Kolonie Biofilmen von Pseudomonas Aeruginosa, Pseudomonas Synxantha, Bacillus Subtilisund Vibrio Choleraeangewandt. Das hohe Niveau der Details sichtbar in Proben von dieser Methode generiert kombiniert mit Reporter Stamm Engineering oder die Verwendung von bestimmten Farbstoffen, bieten spannende Einblicke in die Physiologie und Entwicklung mikrobieller Gemeinschaften.

Diese Methode generiert Biofilm dünn-Abschnitte wobei morphologische Merkmale und Zonen der Genexpression durch DIC, Fluoreszenz-Mikroskopie und TEM abgebildet werden können. Während DIC Bildgebung mit einem 40 X Öl Immersion Ziel darzutun, einige morphologische Merkmale (Abb. 2E) sein kann, wir haben festgestellt, dass Fluoreszenz Mikroskopie Stämme entwickelt, um konstitutiv express fluoreszierendes Protein liefert verbesserte Visualisierung der Zelle Verteilung innerhalb der Stichprobe (Abb. 2D). Bilder der einzelnen Abschnitte können zusammen genäht, um einen Querschnitt durch die gesamte Kolonie (Abbildung 2 b) zu generieren und Kontext für die Lokalisierung der strukturellen Merkmale innerhalb der allgemeinen Morphologie auf der makroskopischen Ebene (Vergleiche bereitstellen Abbildung 2A, B, und C). Morphologische Merkmale und fluoreszierende Signale können imaging Software14gemessen werden. Strukturen innerhalb des Biofilms oder Übergänge zwischen den Zonen der gen-Expression können dann mit Ausschüttungen von Metaboliten oder chemischen Gradienten11 korreliert werden.
Dieses Protokoll kann geändert und in mehrfacher Hinsicht angepasst werden. Verwendung eines Stammes entwickelt, um ausdrückliche fluoreszierenden Proteins unter der Kontrolle eines spezifischen Promotors ermöglicht die Visualisierung der Verteilung der Genexpression (Abb. 3A). Kolonien können auf Farbstoffe,-haltigem Medium angebaut werden oder Farbstoffe zugesetzt werden, nach dem Schneiden, um spezifischen Polysaccharide Fleck (Abb. 3 b und C). Zu guter Letzt können Proben vorbereitet in eine modifizierte Version dieses Protokolls durch TEM (Abbildung 3D) ermöglicht Visualisierung mit höherer Auflösung als die durch DIC aktiviert oder Fluoreszenz-Mikroskopie untersucht werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57196/57196fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung Setup für Koloniewachstum vor der Fixierung. (A) Kolonien wachsen auf zwei Schichten von erstarrtem Agar Wachstumsmedium (oben und unten) und (B) werden dann mit einer zusätzlichen Schicht (Overlay), die Kolonie Morphologie bewahrt überlagert. (C) die Kolonie zwischen dem Overlay und oberste Schicht ist dann von der Unterschicht zur Weiterverarbeitung getrennt. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57196/57196fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57196/57196fig2.jpg"> Abbildung 2: Mikromorphologischer Features und YFP Fluoreszenz in Querschnitten von Paraffin-eingebetteten Kolonien. Repräsentative Daten für Pseudomonas Aeruginosa PA14 ΔPhz Kolonie15 YFP konstitutiv zum Ausdruck zu bringen und für 3 Tage auf 1 % Tryptone, 1 % Agar mit Kongo-rot und Coomassie Blau angebaut. (A) Draufsicht, Fluoreszenzbild zeigt die Hälfte einer Kolonie vor der Fixierung. (B) Querschnitt der gesamten Kolonie nach dem Paraffin einbetten. Die Box Bereich wurde mit einem 10 X-Objektiv (C) abgebildet. Die Box Bereich (c) wurde dann mit einem 40 X Objektiv Öl eintauchen, mit Fluoreszenz (D) und DIC (E) abgebildet. Maßstabsleisten stehen 2 mm (A), 500 µm (B) und 100 µm (C-E). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57196/57196fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57196/57196fig3.jpg"> Abbildung 3: Reporter Ausdruck, Pre- und Post-Färbung der Biofilm-Features und TEM Bildgebung von Paraffin-eingebetteten Kolonie Biofilm Proben. (A) MexGPr-GFP Reporter-Fluoreszenz in einer p. Aeruginosa PA14 Kolonie für 3 Tage auf 1 % Tryptone, 1 % Agar gewachsen. (B) Fluoreszenz des gebundenen Kongo-rot in einer p. Synxantha -Kolonie für 5 Tage auf den Farbstoff-haltigem Medium gewachsen. (C) Fluoreszenz der Wisteria Floribunda Lektin Fleck für Pel Polysaccharid in einer p. Aeruginosa PA14 ΔPhz Kolonie (gewachsen für 2 Tage auf 1 % Tryptone, 1 % Agar mit Kongo-rot und Coomassie Blau), nach dem Schnitt. (D) TEM Bild von p. Aeruginosa PA14 ΔPhz Kolonie (gewachsen für 3 Tage auf 1 % Tryptone, 1 % Agar mit Kongo-rot und Coomassie Blau), für Schnitt über Paraffin einbetten und verarbeitet *. Maßstabsleiste repräsentiert 40 µm (A-B), 20 µm (C) und 5 µm (D). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57196/57196fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
* In diesem Beispiel wurde für Schnitt über Paraffin einbetten bis Schritt 4 des genannten Protokolls weglassen Schritte 4.1-4.3, verarbeitet und dann separat verarbeitet für TEM-Analysen.

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Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Paraffin einbetten und dünn schneiden von mikrobiellen Kolonie Biofilmen für die mikroskopische Analyse

Wir beschreiben, Fixierung, Paraffin einbetten und dünne Stationspunkte Techniken für mikrobielle Kolonie Biofilmen. In vorbereiteten Proben können Biofilm Unterkonstruktion und Reporter Expressionsmuster von Mikroskopie visualisiert werden.

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.2K Aufrufe.  Columbia University. Wir beschreiben, Fixierung, Paraffin einbetten und dünne Stationspunkte Techniken für mikrobielle Kolonie Biofilmen. In vorbereiteten Proben können Biofilm Unterkonstruktion und Reporter Expressionsmuster von Mikroskopie visualisiert werden.

Serie: Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin sections of the specimen. Although preparing serial ultrathin sections is considered to be very difficult, it is rather easy if the proper method is used. In this paper, we show a step-by-step procedure for safely obtaining serial ultrathin sections of microorganisms. The key points of this method are: 1) to use the large part of the specimen and adjust the specimen surface and knife edge so that they are parallel to each other; 2) to cut serial sections in groups and avoid difficulty in separating sections using a pair of hair strands when retrieving a group of serial sections onto the slit grids; 3) to use a 'Section-holding loop' and avoid mixing up the order of the section groups; 4) to use a 'Water-surface-raising loop' and make sure the sections are positioned on the apex of the water and that they touch the grid first, in order to place them in the desired position on the grids; 5) to use the support film on an aluminum rack and make it easier to recover the sections on the grids and to avoid wrinkling of the support film; and 6) to use a staining tube and avoid accidentally breaking the support films with tweezers. This new method enables obtaining serial ultrathin sections without difficulty. The method makes it possible to analyze cell structures of microorganisms at high resolution in 3D, which cannot be achieved by using the automatic tape-collecting ultramicrotome method and serial block-face or focused ion beam scanning electron microscopy.

This study presents reliable and easy procedures for obtaining serial ultrathin sections of a microorganism without expensive equipment in transmission electron microscopy.

Eine Methode für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen im Transmissions-Elektronenmikroskopie

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

Forschung

Ingenieurwesen

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Methodologien für das Studium<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilme als Modell für kleine Molekül-Inhibitoren Biofilm Charakterisieren

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Immunologie und Infektion

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Hefekolonie Embedding-Methode

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Biologie

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Starre Einbettung von fixiert und gefärbt, im großen und ganzen Millimeter-Skala Exemplare für Abschnitt-free 3D Histologie durch Mikro-Computertomographie

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Biotechnik

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

Mikroskopische Techniken zur Interpretation der Pilzbesiedlung in mykoheterotrophen Pflanzengeweben und der symbiotischen Keimung von Samen

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Histological Sample Preparation for Light Microscopy

Histology is the study of cells and tissues, which is typically aided by the use of a light microscope. The preparation of histological samples can vary greatly based on the inherent properties of the samples such as size and hardness as well as expected post-processing which includes planned staining techniques or other down-stream applications. As described in this video, specimen preparation typically begins with a fixation procedure to prevent degradation of the sample by naturally occurring enzymes that are released by the cells upon death. Once fixed, samples are placed into an embedding medium that is able to sufficiently support the sample. Most commonly this is paraffin wax, but other materials such as a glycerin based freezing medium and agars are also used to surround the sample during sectioning. Sectioning then takes place on a microtome or other cutting device that allows the user to shave the sample into thin slices ranging from a few microns to a few millimeters in thickness. Once cut, sections are mounted on a glass slide and stained to bring out specific features of the sample before being imaged on a microscope.

Histological Sample Prep for a Light Microscope

Das Vorbereiten von histologischen Präparaten für die Lichtmikroskopie

Histology is the study of cells and tissues, which is typically aided by the use of a light microscope.  The preparation of histological samples can vary ...

Lehre

JoVE Science Education

Grundlegende Biologie

Allgemeine Laborverfahren

Formalin-Fixed Paraffin Embedded (FFPE) Tissue Preservation: A Method for Studying Tissue Morphology

Source: Nagaraj A.S., et al., <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58569/establishment-analysis-tumor-slice-explants-as-prerequisite-for">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The following video describes how to preserve morphology of a tissue with formalin fixation and paraffin embedding.

Konservierung von formalinfixiertem Paraffin-eingebettetem (FFPE): Eine Methode zur Untersuchung der Gewebemorphologie

Source: Nagaraj A.S., et al., Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. J. Vis. Exp. (2018)
The ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Krebsforschung

Lung Cancer

Ex vivo study

A Method for Sample Preparation to Visualize Biofilm Forming Bacteria on Fungal Hyphae

Source: Guennoc, Cora Miquel, et al, <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54771">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video describes a method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae using microscopy. Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and involve numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation.

Ein Verfahren zur Probenvorbereitung zur Visualisierung von Biofilm-bildenden Bakterien auf Pilzhyphen

1. Preparation of an In Vitro Biofilm of Bacteria on the Fungal Colony

	Centrifuge the bacterial culture at 5,000 x g for 3 min and suspend the pellet in ...

Immunology

Immunodiagnostics

In Vitro and In Vivo Models

Fixation and Sectioning

Two basic types of preparation are used to visualize specimens with a light microscope: wet mounts and fixed specimens.
The simplest type of preparation is the wet mount, in which the specimen is placed in a drop of liquid on the slide. A liquid specimen can be directly deposited on the slide using a dropper. Solid specimens, such as skin scraping, can be placed on the slide before adding a drop of liquid to prepare the wet mount. Sometimes the liquid is simply water, but stains are often added to enhance contrast. Once the liquid has been added to the slide, a coverslip is placed on top, and the specimen is ready for examination under the microscope.
The second method of preparing specimens for light microscopy is fixation. The &#8220;fixing&#8221; of a sample refers to the process of attaching cells to a slide. Fixation is often achieved by heating (heat fixing) or chemically treating the specimen. In addition to attaching the specimen to the slide, fixation also kills microorganisms in the specimen, stopping their movement and metabolism while preserving the integrity of their cellular components for observation.
To heat-fix a sample, a thin layer of the specimen is spread on the slide (called a smear), and the slide is then briefly heated over a heat source. Chemical fixatives are often preferable to heat for tissue specimens. Chemical agents such as acetic acid, ethanol, methanol, formaldehyde (formalin), and glutaraldehyde can denature proteins, stop biochemical reactions, and stabilize cell structures in tissue samples.
In addition to fixation, staining is almost always applied to color certain features of a specimen before examining it under a light microscope. Stains, or dyes, contain salts made up of a positive ion and a negative ion. Depending on the type of dye, the positive or the negative ion may be the chromophore (the colored ion); and the other uncolored ion is called the counterion. If the chromophore is the positively charged ion, the stain is classified as a basic dye; if the negative ion is the chromophore, the stain is considered an acidic dye.
Dyes are selected for staining based on the chemical properties of the dye and the specimen being observed, which determine how the dye will interact with the specimen. In most cases, it is preferable to use a positive stain, a dye that will be absorbed by the cells or organisms being observed, adding color to objects of interest to make them stand out against the background. However, there are scenarios where it is advantageous to use a negative stain absorbed by the background but not by the cells or organisms in the specimen. Negative staining produces an outline or silhouette of the organisms against a colorful background.
Because cells typically have negatively charged cell walls, the positive chromophores in basic dyes tend to stick to the cell walls, making them positive stains. Thus, basic dyes such as basic fuchsin, crystal violet, malachite green, methylene blue, and safranin typically serve as positive stains. On the other hand, the negatively charged chromophores in acidic dyes are repelled by negatively charged cell walls, making them negative stains. Commonly used acidic dyes include acid fuchsin, eosin, and rose bengal.
Some staining techniques involve the application of only one dye to the sample; others require more than one dye. In simple staining, a single dye is used to emphasize particular structures in the specimen. A simple stain will generally make all of the organisms in a sample appear the same color, even if the sample contains more than one type of organism. In contrast, differential staining distinguishes organisms based on their interactions with multiple stains. In other words, two organisms in a differentially stained sample may appear different colors. Differential staining techniques commonly used in clinical settings include Gram staining, acid-fast staining, endospore staining, flagella staining, and capsule staining.
This text is adapted from <a href="https://openstax.org/books/microbiology/pages/2-4-staining-microscopic-specimens">Openstax, Microbiology 2e, Section 2.4: </a><a href="https://openstax.org/books/microbiology/pages/2-4-staining-microscopic-specimens">Staining microscopic specimens</a>

Fixierung und Sektionierung

Two basic types of preparation are used to visualize specimens with a light microscope: wet mounts and fixed specimens.
The simplest type of preparation ...