Name: visualizing lignification dynamics in plants with click chemistry: dual labeling is bliss!
Uploaded: 2018-01-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS! at JoVE.com

אנחנו חבים את FRABio הפדרציה מחקר ולמערכת הדמיה TisBio (אונ' Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et במכלולים des Fonctionnelle Biomoléculaires) למתן הסביבה טכני להצטיינות להשיג את זה עבודה.

<ol>
	<li>Grammel, M., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+reporters+for+biological+discovery.">Chemical reporters for biological discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (8), 475-484 (2013).</li><li>Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+in+living+systems.">Chemistry in living systems.</a> Nat Chem Biol. 1 (1), 13-21 (2005).</li><li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+chemistry:+fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality.">Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (38), 6974-6998 (2009).</li><li>Chang, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars.">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (22), 4030-4033 (2009).</li><li>Gilormini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sequential+bioorthogonal+dual+strategy:+ManNAl+and+SiaNAl+as+distinct+tools+to+unravel+sialic+acid+metabolic+pathways.">A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways.</a> Chem. Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).</li><li>Mbua, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+accumulation+and+recycling+of+glycoproteins+visualized+in+Niemann-Pick+type+C+cells+using+the+chemical+reporter+strategy.">Abnormal accumulation and recycling of glycoproteins visualized in Niemann-Pick type C cells using the chemical reporter strategy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (25), 10207-10212 (2013).</li><li>Anderson, C. T., Wallace, I. S., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+click-labeling+with+a+fucose+analog+reveals+pectin+delivery,+architecture,+and+dynamics+in+Arabidopsis+cell+walls.">Metabolic click-labeling with a fucose analog reveals pectin delivery, architecture, and dynamics in Arabidopsis cell walls.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1329-1334 (2012).</li><li>Tobimatsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+click+chemistry+strategy+for+visualization+of+plant+cell+wall+lignification.">A click chemistry strategy for visualization of plant cell wall lignification.</a> Chem. Commun. 50 (82), 12262-12265 (2014).</li><li>Bukowski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+clickable+designer+monolignol+for+interrogation+of+lignification+in+plant+cell+walls.">Development of a clickable designer monolignol for interrogation of lignification in plant cell walls.</a> Bioconjugate Chem. 25 (12), 2189-2196 (2014).</li><li>Pandey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+click-compatible+monolignol+probe+to+study+lignin+deposition+in+plant+cell+walls.">A versatile click-compatible monolignol probe to study lignin deposition in plant cell walls.</a> PLOS ONE. 10 (4), e0121334 (2015).</li><li>Pandey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+biochemical+and+developmental+dependencies+of+lignification+with+a+click-compatible+monolignol+analog+in+Arabidopsis+thaliana+stems.">Investigating biochemical and developmental dependencies of lignification with a click-compatible monolignol analog in Arabidopsis thaliana stems.</a> Front Plant Sci. 7, (2016).</li><li>Zhu, Y., Wu, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+and+imaging+of+N-linked+glycans+in+Arabidopsis+thaliana.">Metabolic labeling and imaging of N-linked glycans in Arabidopsis thaliana.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (32), 9301-9305 (2016).</li><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+biosynthesis.">Lignin biosynthesis.</a> Annu Rev Plant Biol. 54, 519-546 (2003).</li><li>Weng, J. -. K., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+lignin+biosynthesis.">The origin and evolution of lignin biosynthesis.</a> New Phytol. 187 (2), 273-285 (2010).</li><li>Mottiar, Y., Vanholme, R., Boerjan, W., Ralph, J., Mansfield, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+lignins:+harnessing+the+plasticity+of+lignification.">Designer lignins: harnessing the plasticity of lignification.</a> Curr Opin Biotechnol. 37, 190-200 (2016).</li><li>Rinaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+the+way+for+lignin+valorisation:+recent+advances+in+bioengineering,+biorefining+and+catalysis.">Paving the way for lignin valorisation: recent advances in bioengineering, biorefining and catalysis.</a> Ange Chemie (Int Ed). 55 (29), 8164-8215 (2016).</li><li>Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+glycoengineering+with+N-acyl+side+chain+modified+mannosamines.">Metabolic glycoengineering with N-acyl side chain modified mannosamines.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (33), 9482-9512 (2016).</li><li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifunctional+unnatural+sialic+acids+for+dual+metabolic+labeling+of+cell-surface+sialylated+glycans.">Bifunctional unnatural sialic acids for dual metabolic labeling of cell-surface sialylated glycans.</a> J Am Chem Soc. 135 (25), 9244-9247 (2013).</li><li>Dumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+wall+imaging+by+metabolic+click-mediated+labelling+of+rhamnogalacturonan+II+using+azido+3-deoxy-+d+-+manno+-oct-2-ulosonic+acid.">Plant cell wall imaging by metabolic click-mediated labelling of rhamnogalacturonan II using azido 3-deoxy- d - manno -oct-2-ulosonic acid.</a> Plant J. 85 (3), 437-447 (2016).</li><li>Niederwieser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+glycan+labeling+of+live+cells+by+a+combination+of+Diels-Alder+and+click+chemistry.">Two-color glycan labeling of live cells by a combination of Diels-Alder and click chemistry.</a> Ange Chemie Int Ed. 52 (15), 4265-4268 (2013).</li><li>Sp&#228;te, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+norbornene-modified+mannosamine+derivatives+for+metabolic+glycoengineering.">Exploring the potential of norbornene-modified mannosamine derivatives for metabolic glycoengineering.</a> Chem Bio Chem. 17 (14), 1374-1383 (2016).</li><li>Sp&#228;te, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Labeling+of+metabolically+engineered+cell-surface+glycoconjugates+with+a+carbamate-linked+cyclopropene+reporter.">Rapid Labeling of metabolically engineered cell-surface glycoconjugates with a carbamate-linked cyclopropene reporter.</a> Bioconjugate Chem. 25 (1), 147-154 (2014).</li><li>Lion, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLISS:+a+bioorthogonal+dual-labeling+strategy+to+unravel+lignification+dynamics+in+plants.">BLISS: a bioorthogonal dual-labeling strategy to unravel lignification dynamics in plants.</a> Cell Chem Biol. 24 (3), 326-338 (2017).</li><li>del R&#237;o, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+guaiacyl-rich+lignins+in+flax+(Linum+usitatissimum)+fibers+and+shives.">Structural characterization of guaiacyl-rich lignins in flax (Linum usitatissimum) fibers and shives.</a> J Agric Food Chemist. 59 (20), 11088-11099 (2011).</li><li>Huis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+hypolignification+is+associated+with+extensive+oligolignol+accumulation+in+flax+stems.">Natural hypolignification is associated with extensive oligolignol accumulation in flax stems.</a> Plant Physiol. 158 (4), 1893-1915 (2012).</li><li>Chantreau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+lignification+in+the+flax+lignified+bast+fiber1+mutant+stem+is+associated+with+tissue-specific+modifications+in+gene+expression+and+cell+wall+composition.">Ectopic lignification in the flax lignified bast fiber1 mutant stem is associated with tissue-specific modifications in gene expression and cell wall composition.</a> The Plant Cell. 26 (11), 4462-4482 (2014).</li><li>Terashima, N., Ko, C., Matsushita, Y., Westermark, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolignol+glucosides+as+intermediate+compounds+in+lignin+biosynthesis.+Revisiting+the+cell+wall+lignification+and+new+13C-tracer+experiments+with+Ginkgo+biloba+and+Magnolia+liliiflora.">Monolignol glucosides as intermediate compounds in lignin biosynthesis. Revisiting the cell wall lignification and new 13C-tracer experiments with Ginkgo biloba and Magnolia liliiflora.</a> Holzforschung. 70 (9), 801-810 (2016).</li><li>Noel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+CMP-sialic+acid+donor+specificity+of+two+human+&#946;-d-galactoside+sialyltransferases+(ST3Gal+I+and+ST6Gal+I)+selectively+acting+on+O-+and+N-glycosylproteins.">Probing the CMP-sialic acid donor specificity of two human &#946;-d-galactoside sialyltransferases (ST3Gal I and ST6Gal I) selectively acting on O- and N-glycosylproteins.</a> Chembiochem: Eur J Chem Biol. , (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

כאמור, הפרוטוקול אושר כפול תיוג שהוצגו במאמר זה היא אחת הדוגמאות הראשונות SPAAC/CuAAC שילוב ויוו12,23. כל שלב היה ביסודיות ממוטב לאמת ואני זה מאוד חשוב כי הסדר שבו השניים לחץ על כימיה תיוג תגובות ברצף מבוצעות מכובד (קרי, SPAAC, ואחריו CuAAC). הצלב כל-הפקדים הראה כי כל שלב תיוג היא ספציפית כאשר הפרוטוקול אושר יישומית23 : ביצוע השלב SPAAC הראשון מוביל chemoselective מאוד תיוג של HAZ אזיד פונקציות על-ידי cyclooctyne functionalized fluorophore דרך תגובה [3 + 2] cycloaddition עם קינטיקה מהר. ברגע יחידות HAZ מתויגים, השלב CuAAC המחייב הפעלה copper(I) מזורז של GALK alkynes מסוף כדי ליצור קישורים triazole על ידי תגובה עם החללית 545 אזיד-עבור חיל הים יכול להתבצע. לעומת זאת, הסדר ההפוך (קרי, CuAAC, ואחריו SPAAC) לא אמור לשמש כמו זה מוביל ליחידה GALK ו- HAZ קרוס-מצמד, אשר מתחרה עם fluorophore מצדו ומשרה ההפסד הדרמטי של האות . חשוב גם להדגיש את נחיצות השלבים כביסה ביניים כדי למנוע כתמים שאינם ספציפיים.
אנחנו הראו כי השיטה שלנו ניתן להחיל עיצובים ניסוי ביולוגיים שונים. האושר תיוג פרוטוקול הוחל לראשונה על חתכים ביד חופשית של גבעולים זרעי פשתן (כ 150-250 מיקרומטר עבה) היו בעבר לחתוך, מודגרות עם monolignols מוכן-לחץ. למרות העיצוב הזה יש את היתרון של צמצום הכמויות הדרושות של הכתב כימי (כפי הדגירה כרכים מופחתים) ושל הקלת ייצור ושכפול סטטיסטית, זה לא, אם אתה קפדן, מערכת ויוו מסוימים המקרים, אינן משקפות בהכרח בכל ההיבטים של דינמיקה lignification אמיתי-עתיים. בתכנון הניסוי השני, לכן התאמנו הפרוטוקול אושר שיטה שבה השתמשת קודם לכן כדי ללמוד שילוב של monolignols radiolabeled אורן, גינקו27. בגישה זו, השורשים ואת גזע של הצמח מופרדים פיזית, הבסיס של כל גזע מודגרת בפתרון monolignol ב מה עשוי להיות שכונה הגישה "אגרטל פרחים". לאחר שעזב את הגבעולים זמן הרצוי (הדגירה), חתכים הם גזור את הפרוטוקול אושר לבצע. זו אפשרה לנו להראות (i) כי monolignols ששונה מועברים דרך הגבעול חי, משולבים גדל ליגנין פולימרים בתוך קירות התא ואת (ii) כי התבנית לוקליזציה היה בעיקרו של דבר זהה לזו של חתך הרוחב הגישה. זה סוג של ניסוי יש בצורך מבוצע ב צמח חי ואמיתי / תא חי לגשת ומאפשר יותר ניסויים ומחקרים מעמיקים יותר, אך דורשת כמויות יותר כתב כימי. לבסוף, הפרוטוקול אושר שימש גם עם שתילים מפעל פשתן, ייצוג אמיתי חי צמח מודל שבו העיתונאים כימי כנראה נספג דרך השורשים לפני מובלים את הגבעול. בעוד מודל זה יש יתרון ברור של מבוצע ב צמחים חיים, בפועל, זה מוגבל השתילים והוא לא מתאים באמת חוקרים lignification dynamics צמחים בוגרים מסיבות מעשיות (זמן דגירה ארוך, מוגבה כמות של עיתונאים כימי). ובכל זאת, עיצובים ניסוי שלושת אלה הם משלימים, ובכולם יש היתרונות והחסרונות שלהם לגבי ההיבטים המעשיים ומשמעויות ביולוגי בהתאם לסוג השאלה ביולוגי שנענתה.
שפותחה כדי ללמוד את הדינמיקה lignification של פשתן, פרוטוקול שלנו היא מאוד, לא רק מבחינת עיצוב הניסוי הביולוגי, אלא גם מבחינת היישום שלה לשני צמח מינים ורקמות/איברים. למשל, האושר ניתן בקלות להעביר את תודרנית או סוגים של צפצפה נתונות יותר מחקרים עם מוטציות מעלף או דפיקה למטה עבור גנים שונים. בעקרון, מחקרים תיוג כפול עם הגישה שלנו גם ניתן להרחיב את מולקולות אחרות באמצעות שני מבשרי ששונה ברורים של הצמח דופן התא פולימרים - כולל כל שלוש monolignols הראשי או סימנים מקדימים חילוף החומרים שלהם גם כן שונים כמו monosaccharides המהווים המטריקס רב-סוכר. מאז הקמתה, כימיה bioorthogonal אכן בעיקר פותחה כדי לחקור glycans/פוליסכרידים-פחמימה # מיון הפחמימות מטבולית הנדסה (מו)4,5,17,28, אבל באופן מפתיע היו רק מעט מאוד יישומי לשתול ביולוגיה כה7,8,9,10,11,12. מבחינת תאימות של התגובות, המחקר של ליגנין אכן היה תיק מורכב לפתור כמו שני כתבים כימי משולבים באותה רשת לסופרמרקטים הפולימר. האפשרות של Hללא תוויתAZ-GALK קישור היווצרות היה ההיבט להתגבר בשל הקרבה המרחבי של GALK ויחידותAZ Hבתוך 3D מבנה של ליגנין23, מגבלה זה עשויים שלא להופיע אם הכתבים כימי שני אינם כלולים באותו סוג של ביופולימרים או באותו אזור המרחבי של תא נתון כלשהו.
בהיקף רחב יותר המתודולוגיה בליס יכול בעצם להיות מיושם בכל מחקר הדמיה של שני צבעים פלורסצנטיות במודלים חיידקי או בעלי חיים באמצעות שני הכתבים כימיים ברורים הנושאת אזיד תג ותג מסוף אלקין, בהתאמה.

בשני העשורים האחרונים, האסטרטגיה כתב כימי התפתחה מתודולוגיה שני שלבים חזק כדי לחקור את הדינמיקה ואת הפונקציות של מולקולות שאינן גנטית מקודד. 1 , 2 , 3 באסטרטגיה אנלוגי סינתטי של biomolecule עניין עם אפנון קטן – כתב כימי – עובר תחילה מטבוליזם האורגניזם החי, ולאחר מכן בדיקה כימית (למשל., fluorophore על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה קונפוקלית הדמיה) קשורה covalently הכתב incorporated ויה bioorthogonal לחץ על כימיה. המכשיר חייב להגיב במהירות, במיוחד עם השינוי כימי הציג בעת היותו אינרטי כדי כל מולקולות נוכח במערכת החיים. במובנים רבים, שיטה זו גוברת על המגבלות של טכניקות נפוצות bioconjugation באמצעות לחץ ספציפי מאוד כימיה ligations ובכך מספק הזדמנות לעקוב מטבוליטים או ובמקרו-מולקולות ביולוגיות כי היו נגישים בעבר חי מערכות4,5,6.
למרות הפופולריות בצמיחה מהירה של שיטה זו עוצמה של תאים חיידקיים ובעלי חיים, דוחות המתאר את השימוש בביולוגית הצמח הם כמה מפתיע, המרחק בין7,8,9,10, 11,12. היינו מעוניינים במיוחד ליישם אסטרטגיה זו בצמחים ללמוד היווצרות של ליגנין, לאחד biopolymers הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ, מרכיב עיקרי של ביומסה lignocellulosic. 13 , 14 ליגנין הוא פולימר בעל תאים פנוליים זה ממלא תפקיד חיוני הגנה מבניים בתחום הפיתוח החיים של צמחים.
הוא בדרך כלל מורכב moieties 4-hydroxyphenylpropanoid שלושה: H (p- hydroxyphenyl), G (guaiacyl) ויחידות S (syringyl) נגזר בהתאמה בין 3 'monolignols' (p- coumaryl, coniferyl ו- sinapyl כהלים) כי הם מסונתז דרך השביל phenylpropanoid בציטופלסמה של התא (איור 1). לאחר להיות מיוצא דופן התא, monolignols הם מחומצן לקיצוניים peroxidases או laccases לאחר מכן הם עוברים צימוד הרדיקלי גרידא כימי תגובות פולימריזציה כדי ליגנין פולימרים, תהליך הנקרא lignification. 15 , 16 למרות lignins חריפה להשפיע על valorization תעשייתי של רבים הצמחי מוצרים, הקהילה המדעית יש עדיין דרך ארוכה ללכת כדי לפענח את המנגנון הסבוך ויסות lignification לו.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig1.jpg"> איור 1: תהליך lignification בתאי צמח. Monolignols הם biosynthesized של פנילאלנין ב ציטוזול. לאחר להיות מיוצא דופן התא, monolignols הם מחומצן לקיצוניים peroxidases או laccases לאחר מכן הם עוברים צימוד הרדיקלי גרידא כימי תגובות פולימריזציה כדי ליגנין פולימרים, תהליך הנקרא lignification. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56947/56947fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
למרות דיווחים על השימוש bioorthogonal תגובות לניתוח glycan רבים,2,3,17 שלהם יישום דוגמאות לסוגים אחרים של מולקולות הן פחות. השימוש bioorthogonal כימיה למטרות bioimaging ליגנין רק לאחרונה היה חלוץ ידי. Tobimatsu et al. 8 ב תודרנית לבנה כדי לספק מידע אודות שילוב של coniferyl המחליפים אלכוהול לתוך הפולימר ליגנין איפה זה יוצר את יחידות G,8,9 ובכך הממחיש את הוכחת את זה כתב כימי אסטרטגיות ישימות בהקשר זה. השימוש CuAAC היה ללמוד גם באמצעות נגזרת אלכוהול שונים coniferyl חודש כמה מאוחר יותר בוקובסקי ואח. 9 . אולם, ליגנין מכיל גם יחידות H ו- S הבנה עמוקה יותר של תהליך lignification דורש יותר ידע איך כל monolignols משולבים הפולימר, מה הגורמים עשויות לשלוט הקומפוזיציה שלה. הפיתוחים החדשים בתחום זה כיום תלויים פיתוח מתודולוגיות יעיל כדי לעקוב אחר כתבים כימיות מרובות בו-זמנית במערכות החיים. אף-על-פי כמה כתבות על glycans הניחו את היסודות בשנים האחרונות18,19,20,21,22, כפול תיוג גישות נשארים אתגר גדול ב bioorthogonal כימיה. אם פרוטוקול לחץ לשחזור תיוג-יחיד הוא קשה לפתח, ואז כפול תיוג גישות הדורשים אופטימיזציה במשולב שני הדדית תואמת bioorthogonal תגובות על שני הכתבים כימיים נפרדים הם אפילו יותר קשה. כמה דוגמאות כי חלוץ היבט זה השתמשו בשילוב של אזיד-אלקין אתקרב זן cycloaddition (SPAAC) ותגובות תגובת דילס-אלדר (DAinv) דרישה אלקטרונית הופכי אלקן-tetrazine ללמוד glycans בתאים בעלי חיים. עם זאת, חשבנו כי bioorthogonality התגובה DAinv לא יכול להיות מובטח ביישום זה בשל המאפיינים המבניים של ליגנין (אשר מורכב של מונומרים אלקטרון-עשיר cinnamyl שהוחלפו מסוג זה יכול להגיב עם אלקטרון עלוב האוויר דינס כגון הגששים tetrazine המשמש בתגובות DAinv), כי זה עלול לייצר שאינם ספציפיים תיוג. בנוסף, התגובהinv DA דורש ידיות כימיים קשים לאכסון גישה, כמו גם להיות מגושם ולא lipophilic ובכך מעלים את האפשרות כי הקצב של התאגדות, תחבורה ו/או לוקליזציה של החומר הכימי כתב ויוו עלולים להיות מושפעים. כפי שקלנו כי ההיבט האחרון היה רלוונטי במיוחד במקרה של גישה כימיה בלחיצה ללמוד lignification, אנחנו בחרה בכיוון שונה ופיתח באמצעות Bioorthogonal מצדו הדמיה רציפים אסטרטגיה (אושר) שילוב של Cycloaddition אזיד-אלקין Strain-Promoted (SPAAC) ו- Cycloaddition אזיד-אלקין קטליזת של נחושת (CuAAC) ויוו. 23
תגובות שני אלו הם אכן שני bioorthogonal הראשי לחץ על תגובות בהן השתמשו עד כה, יותר בפרט כמה דוגמאות של ליגנין הדמיה אשר פורסמו לאחרונה. 8 , 9 אסטרטגיית תיוג כפול שלנו מאפשרת את השימוש של אזיד moiety על monolignol אחד כתב וידיות של אלקין מסוף מצד שני, שני הכימי i) אינרטיים לכיוון מבנים רלוונטי מבחינה ביולוגית, ii) מאוד קטנים בגודלם (איור 2 ). כתוצאה, ההשפעה של אלה שינויים סינתטי על המאפיינים physicochemical של biomolecule שנבחנה ממוזער ובכך להקטין אפשרי אי-התאמות בין סובסטרטים לא טבעיים, הטבעית monolignol מבחינת תחבורה, metabolization המחירים במהלך השלב התאגדות מטבולית. למרות השילוב של SPAAC ו- CuAAC נראה מאוד אינטואיטיבי במבט ראשון, זה לידע שלנו רק הדוגמה השניה של סימון כפול באמצעות אסטרטגיה זו לבין היישום הראשון על מבנים שאינם glycans. 12 , 23
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig2.jpg"> איור 2: אושר כפול תיוג אסטרטגיה. כתבים כימי HAZ GALK מתויג אנלוגים של monolignols מקורית H ו- G בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. הם משולבים קודם פולימרים ליגנין הגוברת של קירות התא על ידי האכלת אקסוגני (שלב 1). Cyclooctyne - ו אזיד-functionalized הגששים פלורסנט ואז ברצף מאתרים בפני הכתבים incorporated מאת bioorthogonal לחץ על כימיה: התגובה SPAAC (שלב 2) הוא מאוד ספציפי של יחידות HAZ , ואחריו (התגובה CuAAC שלב 3) זה מפורט של GALK יחידות (שלב 3), ובכך לאפשר לוקליזציה ספציפי של שני עיתונאים באופן עצמאי במדגם זהה. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56947/56947fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
אנו ראשית המיועד לאמת את monolignol מתויג אזיד כתב HAZ (ממלא מקום של p- coumaryl אלכוהול), קודמן של יחידות ליגנין H ו ואז המציאו את אושר כפול תיוג האסטרטגיה שבה הוא משמש במשולב עם קודם לכן דווח מתויג אלקין GALK,9 (ממלא מקום של אלכוהול coniferyl), קודמן של ליגנין G יחידות. ב פרוטוקול לשחזור זה פיתח ובחן, פשתן, זן צמח חשוב מבחינה כלכלית, שילוב מטבולית כפול של HAZ ו- GALK לתוך ליגנין מושגת קודם לפני רציפים SPAAC/CuAAC תיוג. כאן, מתויג HAZ יחידות תחילה במפורש מסומנות באמצעות מצדו SPAAC של fluorophore cyclooctyne-functionalized, ואחריו בתיווך CuAAC מצדו של בדיקה פלורסנט השני במתויג GALK יחידות. שיטה זו שימש לחקור את הדינמיקה של תהליכים lignification בתוך קירות התא צמח וניתן יישומית ויוו לבלום חתכים, חיים נובע, כמו גם אחרים-שתילים, מינים שונים.

<table><tbody><tr><td>(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (&lt;strong&gt;H&lt;sub&gt;AZ&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Synthesized as in Lion &lt;em&gt;et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>(&lt;em&gt;E&lt;/em&gt;)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (&lt;strong&gt;G&lt;sub&gt;ALK&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Synthesized as in Lion &lt;em&gt;et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>2% sodium hypochlorite</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 cm high glass tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL Schott glass bottle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>48-well Plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5/6-TAMRA-PEG&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;-Azide</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-AZ109-1</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cheese cloth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compost containing clay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coniferyl alcohol (&lt;strong&gt;G&lt;/strong&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00002922</td><td></td></tr><tr><td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DBCO-PEG&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-5/6-Carboxyrhodamine 110</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-A127-1</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Ultrapure water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flax seeds (&lt;em&gt;L. usitatissimum&lt;/em&gt; L.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G&amp;trade; Slide Mounting Medium</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>CLF-Plant Climatics</td><td></td><td>For 2-week-old plants culture</td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>Angelantoni Life Sciences</td><td></td><td>For 2-month-old plants culture</td></tr><tr><td>Magenta plant culture box</td><td></td><td></td><td>For 2-week-old seedling culture</td></tr><tr><td>Methanol</td><td></td><td></td><td>Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R confocal microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-Coumaryl alcohol (&lt;strong&gt;H&lt;/strong&gt;)</td><td>Carbosynth</td><td>FC145653</td><td></td></tr><tr><td>Plastic cap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic pot</td><td></td><td></td><td>For 2-month-old plants culture</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rubber band</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Ascorbate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile clamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vertical support</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for liquid and solid &amp;frac12; MS medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiamine.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing lignification dynamics in plants with click chemistry: dual labeling is bliss!

ליגנין הוא לאחד biopolymers הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ, מרכיב עיקרי של ביומסה lignocellulosic. זה פולימר בעל תאים פנוליים ממלא תפקיד חיוני הגנה מבניים בתחום הפיתוח החיים של צמחים. למרות מורכבות מנגנוני ויסות lignification תהליכים ויוו חריפה להשפעה של valorization תעשייתי של מוצרים רבים הצמחי, הקהילה המדעית יש עדיין דרך ארוכה ללכת בשביל לפענח אותם. ב- 3 שלבים פשוטים זרימת עבודה, פרוטוקול תיוג כפול שהוצגו במסמך זה מאפשר bioimaging מחקרים של פעיל lignifying אזורי של רקמות הצמח. הצעד הראשון מורכב ב שיתוף מטבולית של שני עיתונאים כימי עצמאית, המחליפים של שני monolignols מקורי כי להצמיח ליגנין H-G-יחידות. לאחר שהשתלבה גדל ליגנין פולימרים, כל כתב אז במיוחד תווית משלו בדיקה פלורסנט באמצעות שילוב רציפים של bioorthogonal SPAAC/CuAAC לחץ על תגובות. בשילוב עם autofluorescence ליגנין, גישה זו מובילה הדור של מפות תלת-צבעי לוקליזציה של ליגנין בתוך קירות התא הצמח על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי פלורסצנטיות, מספק מידע מדויק המרחבי על נוכחות או היעדרות של פעיל מכונות lignification-קנה המידה של צמח רקמות, תאים ושכבות שונות דופן התא.

באמצעות פרוטוקול בליס הציג מעורבים תחליפי monolignol סינתטי ו bioorthogonal לחץ על כימיה, ניתן לדמיין את הדינמיקה של תהליך lignification צמחים חיים. בניגוד טכניקות הוקמה ליגנין ויזואליזציה (כגון פתולוגיה מכתים, immunolocalization או autofluorescence), זה "לחיצה כפולה' פרוטוקול באופן בלעדי מטרות של ליגנין המיוצר de novo במהלך שיתוף מטבולית צעד ומבדיל ליגנין שישנו המדגם עם הדמיה הסלולר ערוץ שלוש פעמים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי קרינה פלואורסצנטית (איור 3). H AZ-יחידות מזוהים באמצעות עירור, פליטה אורכי הגל של DBCO-יתד4-5/6-carboxyrhodamine 110 זה במיוחד שלוחצים על גבי אזיד פונקציות של שילב HAZ מולקולות במהלך השלב SPAAC (λex 501 nm /λem 526 ננומטר, הערוץ הירוק), ואילו GALK-יחידות מזוהים באופן דומה בכל אורכי הגל האופיינית של המכשיר azidefluor 545 זה במיוחד שלוחצים על התגים incorporated אלקין מסוף של G ALK במהלך השלב CuAAC (λex 546 nm /λem 565 nm, אדום ערוץ); הערוץ השלישי מקביל ליגנין הקיימת מראש, אשר מזוהה באמצעות autofluorescence מהותי שלה ב 405 ננומטר (ערוץ כחול). גישה זו מובילה הדור של מפות תלת-צבעי לוקליזציה של ליגנין בתוך קירות התא הצמח מספק מידע מדויק המרחבי על נוכחות או היעדרות של מכונות lignification פעיל בין רקמות שונות של איבר (איור 3A ), בין סוגי תאים שונים בתוך הרקמה זהה (איור 3B-C) ובתוך שכבות קיר שונה באותו התא (דמות תלת-ממד). במילים אחרות, מתודולוגיה זו מאפשרת לנו להאיר, במיוחד בתרגום האתרים lignification 'פעיל' (HAZ ו- GALK ערוצים) מאת המבדילים אותם מאזורי איפה ליגנין הוקמה ב שחרור מוקדם שלבי התפתחות הצמח (ערוץ autofluorescence). בנוסף, הרגישות של הטכניקה באופן דרמטי מוגברת בהשוואה autofluorescence, כמויות הרבה יותר קטן של ליגנין טרי מסונתז וניתן זוהה (איור 3B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig3.jpg"> איור 3: הדמיה של כתבות כימי. incorporated monolignol עם גבעולי פשתן. (א) מחצית קטע ואלכסוני בעבודת יד של גזע פשתן, תמונה המשוחזרת. צילום מקרוב של השכבות הראשונות להבדיל עצה (B). עזב לוח: ליגנין autofluorescence (כחול, 405 ננומטר), בחלונית האמצעית: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול) ו- HAZ קרינה פלואורסצנטית (ירוק, 526 ננומטר) ערוצי, לוח נכון: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול) ו- GALK קרינה פלואורסצנטית (565 אדום, nm) ערוצים. החץ מצביע על קיר התא שכותרתו הראשון מ cambium הממחישות את רגישות מוגברת של אושר בהשוואה autofluorescence. (ג) Labeling בתא שונים סוגי עצה משנית (D) מקרוב על עצה משני תאים הממחישות את הווריאציות תיוג ברבדים שונים של דופן התא אותו. עזב לוח: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול) ו- HAZ קרינה פלואורסצנטית (526 ירוק, nm) ערוצי, בחלונית האמצעית: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול) ו- GALK קרינה פלואורסצנטית (565 אדום, nm) ערוצי, ימין לוח: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול), HAZ (ירוק) וערוצי פלורסצנטיות GALK (אדום). לוקליזציה שיתוף HAZ ו- GALK מתואר בצהוב. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56947/56947fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
כתב כימי אסטרטגיות כגון שיטת באושר המובאים כאן או ההליכים תיוג בודד שפורסמו קודם לכן על ידי. Tobimatsu et al. 8 ולכן מאפשר מחקר עדינה יותר הרבה יותר נגישים בעבר שיטות כגון חיסונית - או פתולוגיה מכתים בעת היותו פשוט מאוד ליישם. למשל, איור 4 ממחישה את עוצמת האות עבור HAZ/GALK תיאגוד סיבים tracheids/כלי (FT) עצה משנית פשתן הוא גבוה מאוד בתוך הקירות התא הראשון כמה מן cambium אבל בהדרגה מקטין ב תאים בוגרים. פרופיל זה היא הפוכה מזו של autofluorescence ומציין שאת lignification המרבי מתמלאת במהירות רבה הרבדים תא 2-3 מטרים הראשון מ cambium. לעומת זאת, תאים ריי (R) מופיעים כדי להמשיך lignification על הרבה בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות שלהם כמו HAZ/GALK ההתאגדות היא הרבה יותר מתמיד בקירות של כל התאים מפני cambium הפקק. . זה לא מפתיע כי סוגי תאים מטרים ו- R להציג lignification בניגוד דינמיקה, כיוון מסוגי התאים בעלי תפקידים ביולוגיים שונים עם הבדלים המשויכת בתוכנית ההתפתחותי שלהם. FTs הינם צינורות מאורכים אכן מבוגרים ולא למות במהירות, תאים ריקים מת עוזב עם קירות עבים מעוצה זו ממלאים תפקידים חיוניים תמיכה מכנית והן תעבורה אנכי של מים ומינרלים, ואילו השורות הצר של R תאים זה להלחין את עצה קרני הם בחיים במצבם בוגרת ופונקציונליים מבלי קירות עבים מעוצה.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig4.jpg"> איור 4: ספציפי תא monolignol כתב ההתאגדות בשנת עצה פשתן. ברייט-שדה מיקרוסקופיה קונפוקלית נוף (A) של חלק חתך ביד חופשית של גבעול פשתן. ורוד (ריי parenchyma תאים, R) וצהוב (סיבים tracheid תאים, מטרים) חיצים מציינים את המומנט פורש מאזור cambial לעבר הפקק, תיסרק עבור ליגנין autofluorescence-405 ננומטר (B), קרינה פלואורסצנטית HAZ -526 nm (ג) ו- G ALK זריחה-565 nm (D). (E) מבט עצה משנית. השאיר פאנל: התמזגה ליגנין autofluorescence (כחול), HAZ (ירוק), ו- GALK פלואורסצנטי (אדום) ערוצים. לוקליזציה שיתוף HAZ ו- GALK מתואר בצהוב. לוח נכון: איור סכמטי של המבנה עצה משנית בגזע פשתן. V, כלי השיט; מטרים, tracheid סיבים; R, ריי parenchyma התא. דמות זו שונתה מ. אריה ואח 23 <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56947/56947fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
בנוסף, השימוש של שני הכתבים כימיים ברורים המתאימים כדי H-G-יחידות עם שתי תגובות bioorthogonal בפרוטוקול בליס מאפשר תוצאות כמותיות יותר ואפשר להשיג. מרובב תיוג אסטרטגיות כגון בליס יכולה לספק תובנות נוספות על השליטה של monolignol יחסי התאגדות בתנאים שונים יכול לתרום פענח את התהליך lignification חמקמק. אם האחוזים היחסיים של monolignols H, G ו- S ב- lignins הם אכן משתנה מאוד בהתאם מינים, רקמות, גיל או תנאים סביבתיים של הצמח, המנגנון הסבוך המסדירים ההרכב הזה עדיין לא לגמרי מובנים. הטכנולוגיה תיוג כפול מייצג דרך רבת עוצמה של חוקרים חלק מהפרמטרים המסדירים ההרכב ליגנין. לדוגמה, משתנה את HAZ: GALK יחס עם האושר אפשרה לנו להפגין כי הרכב ליגנין ברקמות עצה משנית היא תלויה ישירות monolignol זמינות בתוך קירות התא, ולא על ירידה לפרטים peroxidase/laccase (איור 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig5.jpg"> איור 5: השפעת המקננת קטעים גזע פשתן עם יחס שונה באחוזים של HAZ ו- GALK. HAZ: GALK% היחס ניתנת מעל כל עמודה של דמויות. העליון: התמזגה HAZ וערוצי GALK . למטה: היסטוגרמות המציין פלורסצנטיות ממוצע עוצמת HAZ ו- GALK עבור יחס שונה %. ערכים מבוטא ממוצע של עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע ב רמות האפור ± SD. סולם בר = 100 מיקרומטר. דמות זו שונתה מ אריה ואח 23 <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56947/56947fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
פשתן הוא גדל על באסט הסיבים שלה (BF) המשמשים לייצור בדים, ניירות יוקרה או חומרים מרוכבים ידידותיים לסביבה. היבט חשוב של valorization תעשייתי שלהם היא שהם מכילים רמות נמוכות מאוד של ליגנין בקירות התא שלהם, אשר מאופיינים על ידי עבות במיוחד S2/G שכבה משני19,24. האושר ניתן לסמן lignification dynamics ההבדלים בין הרבדים השונים של דופן התא אותו. איור 6A מראה התאגדות כתב HAZ ו- GALK מוגבלים תא ופינות, דופן התא (middle lamella) / ראשי של סיבי באסט כמה אך לא כולם. העדר מוחלט של lignification בשכבה עבה באסט סיבים משני תאים קיר גם כאשר הכתבים כימיים monolignol, exogenously סיפק מגלה כי מדינתם hypolignified נובע היעדר סביבה מולקולרית מתאים בתיווך enzymatically חמצון תיאגוד monolignols לתוך שרשרת הפולימר גדל, שזה לא רק בשל רגולציה תעתיק של גנים ביוסינטזה monolignol כאמור דיווחו25. התבוננות זו גם להרכב גם העובדה הזאת peroxidase פשתן הגנים למעלה-מוסדרים ברקמות גזע החיצוני של המוטציה כימי פשתן lbf1 בעלת סיבים באסט מעוצה26.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig6.jpg"> איור 6: אושר מדגיש הבדלים ספציפיים התחתי או שכבות דופן התא. החלונית השמאלית (A): בהיר-שדה תמונה של מקטע גזע פשתן. העיגול מציינת צרור סיבי. לוח נכון: תקריב על סיבי באסט. התמזגה HAZ וערוצי GALK (עם ובלי בהיר-שדה) מציג את lignification מוגבלת תא ופינות (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">), דופן התא (middle lamella) / ראשי של כמה סיבי באסט. BF, באסט סיבים; נקוב, parenchyma תא; M, (middle lamella); P, קיר התא הראשי; S1, השכבה הראשונה של דופן התא משני; שכבה S2/G, משני שכבה/ג'לי של דופן התא משני. פרוסה 2D (B), שחזור תלת-ממד של זום קונאפוקלית z-מחסנית של אזור endodermis שורש פשתן. רצועת Casparian (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) רק מציג autofluorescence ולשלב לא HAZ או GALK. Fluorogram המשויך מראה של GALK/HAZ המתאם אנטי: זריחה ירוק גבוהה קשורה אות אדומה נמוכה (cortex) ולהיפך (endodermis). Pericycle (P), Endodermis (ה), Cortex (C). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56947/56947fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
בסופו של דבר, מתודולוגיה זו שני צבעים יכולים גם לספק מידע רב ערך על 'המדינה lignification' של דופן התא substructures בשלבים התפתחותיים שונים, באיברים צמח שאינו הגבעול. לדוגמה, endodermis של פשתן שורשים מאופיין על ידי קיומה של להקה Casparian חומותיה תא רדיאלי, רוחבי כבר בשלבים המוקדמים של פיתוח. הלהקה של ביופולימרים הידרופוביות, העשוי suberin ו/או ליגנין, מונע מים מומסים בגבול נלקח על ידי שורש מלהיכנס פסיבי דרך אפופלסט ומאלץ אותם לעבור דרך קרום פלזמה דרך מסלול symplastic ובכך לתרום תפיסה סלקטיבית הקיבולות של שורשי צמחים. כאשר מוחל על השורשים פשתן, האסטרטגיה שלנו הראה כי HAZ ו- GALK משולבים בתוך הקירות וקולו של תאים endodermal באותה מידה כמו חלקי הקירות רדיאלי איפה הלהקה Casparian נעדר (איור 6B). עם זאת, העדר מוחלט של התאגדות כתב monolignol בלהקה Casparian עצמו מציין כי הוא בוגר בשלב התפתחותי זה בעוד שאר קירות הם עדיין אתר נוסף ביופולימרים התצהיר. התצוגה 3D המשוחזרת של z-מחסנית מביא בבירור את הלהקה Casparian אור. מעניין, הקירות של כמה תאים בקליפת המוח בצמוד endodermis גם הוכיח יכולת של שילוב HAZ מעדיפים (ובכך המציין את הנוכחות של ליגנין/suberin בקליפת השורש פשתן) אבל לא GALK. ניתוח לוקאליזציה שיתוף הראה אנטי-ומאופיינת HAZ ו- GALK, אשר מציע את קיומו של מכונות מבנה/אנזימטי ספציפי תא קיר באלה שני סוגי תאים סמוכים.
משלימה טבלה 1: הכנת מוצק בינוני ½ MS <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56947/renamed_f17ea.xls">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
משלימה בטבלה 2: ההכנה של פתרונות מניות כתב כימיים <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56947/Table_2_-_Preparation_of_chemical_reporter_stock_solutions.xls">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS! at JoVE.com

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

בליס, פרוטוקול תיוג כפול ללמוד דינמיקה lignification, פותחה. שימוש monolignol סינתטי כתבים ושילוב רציפים של bioorthogonal SPAAC, CuAAC לחץ תגובות, מתודולוגיה זו סוללת את הדרך כדי ניתוח מעמיק של הגורמים המסדירים את להן של lignins ב הפיסקו.

להמחיש Lignification Dynamics בצמחים עם לחץ על כימיה: תיוג כפולה היא האושר!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

visualizing-lignification-dynamics-plants-with-click-chemistry-dual

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Chemistry

11.9K Views.  Université de Lille. בליס, פרוטוקול תיוג כפול ללמוד דינמיקה lignification, פותחה. שימוש monolignol סינתטי כתבים ושילוב רציפים של bioorthogonal SPAAC, CuAAC לחץ תגובות, מתודולוגיה זו סוללת את הדרך כדי ניתוח מעמיק של הגורמים המסדירים את להן של lignins ב הפיסקו.

Video: Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The analysis does not usually require extensive sample preparation; structural and chemical information can be obtained without labeling. However, each Raman image contains thousands of spectra; this raises difficulties when extracting hidden information, especially for components with similar chemical structures. This work introduces a multivariate analysis to address this issue. The protocol establishes a general method to visualize the main components, including lignin, cellulose, and hemicellulose within the plant cell wall. In this protocol, procedures for sample preparation, spectral acquisition, and data processing are described. It is highly dependent upon operator skill at sample preparation and data analysis. By using this approach, a Raman investigation can be performed by a non-specialist user to acquire high-quality data and meaningful results for plant cell wall analysis.

This protocol aims to present a general method to visualize lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls using Raman imaging and multivariate analysis.

שילוב ראמאן הדמיה ניתוח רב משתנים לדמיין ליגנין, תאית, ו Hemicellulose בקיר תא צמחים

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Biochemistry

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

מדידת אינטראקציות בין הפלורסנט לליגנין בסעיפים צמחיים על ידי sFLIM בהתבסס על מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מקורית

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find cost-effective and sustainable solutions has become a topical and critical task. Lignocellulosic biomass is poised to become the primary source of biomass for the conversion to liquid biofuels1-6. However, the recalcitrance of these plant cell wall materials to cost-effective and efficient degradation presents a major impediment for their use in the production of biofuels and chemicals4. In particular, lignin, a complex and irregular poly-phenylpropanoid heteropolymer, becomes problematic to the postharvest deconstruction of lignocellulosic biomass. For example in biomass conversion for biofuels, it inhibits saccharification in processes aimed at producing simple sugars for fermentation7. The effective use of plant biomass for industrial purposes is in fact largely dependent on the extent to which the plant cell wall is lignified. The removal of lignin is a costly and limiting factor8 and lignin has therefore become a key plant breeding and genetic engineering target in order to improve cell wall conversion.
Analytical tools that permit the accurate rapid characterization of lignification of plant cell walls become increasingly important for evaluating a large number of breeding populations. Extractive procedures for the isolation of native components such as lignin are inevitably destructive, bringing about significant chemical and structural modifications9-11. Analytical chemical in situ methods are thus invaluable tools for the compositional and structural characterization of lignocellulosic materials. Raman microscopy is a technique that relies on inelastic or Raman scattering of monochromatic light, like that from a laser, where the shift in energy of the laser photons is related to molecular vibrations and presents an intrinsic label-free molecular "fingerprint" of the sample. Raman microscopy can afford non-destructive and comparatively inexpensive measurements with minimal sample preparation, giving insights into chemical composition and molecular structure in a close to native state. Chemical imaging by confocal Raman microscopy has been previously used for the visualization of the spatial distribution of cellulose and lignin in wood cell walls12-14. Based on these earlier results, we have recently adopted this method to compare lignification in wild type and lignin-deficient transgenic Populus trichocarpa (black cottonwood) stem wood15. Analyzing the lignin Raman bands16,17 in the spectral region between 1,600 and 1,700 cm-1, lignin signal intensity and localization were mapped in situ. Our approach visualized differences in lignin content, localization, and chemical composition. Most recently, we demonstrated Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana with lateral resolution that is sub-&mu;m18. Here, this method is presented affording visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species without staining or labeling of the tissues.

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

A method based on confocal Raman microscopy is presented that affords label-free visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species.

ללא תווית באתרו הדמיה של Lignification בתוך קירות התא הצמח

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

Biology

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In general, for observations over a long period, the technique requires transformation of a fluorescent protein; however, for most systems, genetic transformation is either time-consuming or technically unavailable. This manuscript presents a protocol for 3-D time-lapse imaging of cell wall dynamics over a 3 day period using calcofluor dye (which stains cellulose in the plant cell wall), developed in the moss Physcomitrium patens. The calcofluor dye signal from the cell wall is stable and can last for 1 week without obvious decay. Using this method, it has been shown that the detachment of cells in ggb mutants (in which the protein geranylgeranyltransferase-I beta subunit is knocked out) is caused by unregulated cell expansion and cell wall integrity defects. Moreover, the patterns of calcofluor staining change over time; less intensely stained regions correlate with the future cell expansion/branching sites in the wild type. This method can be applied to many other systems that contain cell walls and that can be stained by calcofluor.

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

This manuscript presents a detailed protocol to image the 3-D cell wall dynamics of living moss tissue, allowing the visualization of the detachment of cell walls in ggb mutants and thickening cell wall patterns in the wild type during development over a long period.

הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר של דינמיקה של דופן התא באמצעות calcofluor ב-Moss Physcomitrium patens

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In ...

Developmental Biology

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

הכתמה histochemical של<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא המשני בוול אלמנטים

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

<meta charset="utf8"></head><body>מיקרוסקופ הרחבה להמחשת גליקנים סיאלילטים תוך תאיים באמצעות MOE

Visualizing Intracellular Sialylation with Click Chemistry and Expansion Microscopy

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes within cells through click and bioorthogonal chemistry. Metabolic oligosaccharide engineering (MOE) has attracted considerable interest due to the essential role of glycosylation in numerous biological processes that involve molecular recognition and its impact on pathologies ranging from cancer to genetic disorders to viral and bacterial infections.
Although MOE is better known for the detection of cell surface glycoconjugates, it is also a very important methodology for the study of intracellular glycans in physiological and pathological contexts. Such studies greatly benefit from high spatial resolution. However, super-resolution microscopy is not readily available in most laboratories and poses challenges for daily implementation. Expansion microscopy is a recent alternative that enhances the resolution of microscopy by physically enlarging biological specimens labeled with fluorescent markers. By embedding the sample in a swellable gel and causing it to expand isotropically through chemical treatment, subcellular structures can be visualized with enhanced precision and resolution without the need for super-resolution techniques.
In this work, we illustrate the capacity of expansion microscopy to visualize intracellular sialylated glycans through the combined use of MOE and click chemistry. Specifically, we propose a procedure for bioorthogonal labeling and expansion microscopy that employs a reporter targeting sialylation, which may be associated with immunofluorescence for co-localization studies. This protocol enables localization studies of sialoconjugate biosynthesis, intracellular trafficking, and recycling.

<meta charset="utf8"></head><body>הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית עם כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה

Here, we propose a simple protocol combining metabolic oligosaccharide engineering, click chemistry, and expansion microscopy that allows bioimaging of intracellular sialylated N-glycoproteins with improved resolution using routine microscopy equipment.

הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית עם כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes ...

Metabolic Labeling

Metabolic labeling is used to probe the biochemical transformations and modifications that occur in a cell. This is accomplished by using chemical analogs that mimic the structure of natural biomolecules. Cells utilize analogs in their endogenous biochemical processes, producing compounds that are labeled. The label allows for the incorporation of detection and affinity tags, which can then be used to elucidate metabolic pathways using other biochemical analytical techniques, such as SDS-PAGE and NMR.
This video introduces the concepts of metabolic labeling and show two general procedures.&#160; The first uses isotopic-labeling, to characterize the phosphorylation of a protein. The second covers a photoreactive labeling to characterize protein-protein interaction within a Also three applications of metabolic labeling are presented: labeling plant material, labeling RNA to measure kinetics and labeling glycans in developing embryos.

<div class="chapter_text" id="script_0">
Metabolic labeling is used to investigate the machinery of a cell. This is accomplished using chemical analogs to probe the biochemical transformations and modifications that occur. This video will show the principles of metabolic labeling, typical isotopic and photoreactive labeling procedures, and some applications.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
Metabolic labeling can be conducted using a number of strategies. Here we will describe isotopic, photoreactive, and bio-orthogonal labeling.
Isotopic labeling is performed using structural analogs that are chemically identical to their natural counterparts, but have uncommon isotopes incorporated into their structure. In this L-lysine analog the carbon and nitrogen atoms are replaced with carbon-13 and nitrogen-15. Cells cultured in the presence of isotopic analogs will incorporate them into their biochemical structures. Metabolites are collected from the cells and purified for analysis. Samples with stable isotopes are analyzed using techniques such as mass spectrometry or NMR spectroscopy. Samples with radioactive labels are analyzed using liquid scintillation counting and x-ray films, which will be demonstrated in the isotopic labeling protocol.
Photoreactive labels are functional groups incorporated into proteins, which are stable until exposed to ultraviolet light. The functional group forms a reactive radical, which binds to the nearest protein. A common example, L-photo-leucine, contains a diazirine ring, which is a photoreactive crosslinker. In contrast to isotopic labeling, there is some chemical dissimilarity between photo-reactive chemical analogs and their natural counterparts. Cells may preferentially incorporate natural compounds over analogs. Therefore, it is important to perform photo-reactive labeling in medium free of the compound being mimicked. Once exposed to ultraviolet radiation, the photo-reactive groups in a labeled protein become unstable and highly reactive, causing it to cross-link with interacting proteins, creating a protein complex. Cross-linked complexes, act as snapshots that can then be analyzed using SDS-PAGE and mass spectrometry methods. This provides insights into what reactions are occurring in the metabolic pathway by identifying reaction species and how they interact by determining binding sites.
Bioorthogonal labeling strategies utilize analogs with small functional groups that have little to no reactivity with natural biomolecules. For example, azides are small functional groups, whose reactivity is said to be orthogonal to biochemical reactions. In the Staudinger ligation, a phosphine group attacks the azido group. This yields a transition state that intramolecularly reacts with a nearby ester, resulting in an amine-bonded ligand. Bioorthogonal functional groups incorporated into biomolecules can be ligated with detection tags such as fluorescent functional groups, and affinity tags such as antigens.
Now that some concepts and strategies for metabolic labeling have been discussed, let&#39;s look at the process in the laboratory.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
The first step in a metabolic labeling experiment is to collect the protein of interest. To do this, cells are grown on a plate, and an expression method is used to promote synthesis of the desired protein. In this example, leucine-rich repeat kinases, or LRRK, are expressed. Disodium phosphate, containing radioactive phosphorus-32, is used as the analog. Proper measures must be taken to protect against ionizing radiation. This includes setting up a work area, wearing proper protective equipment, and checking for radioactive contamination. Once safety measures have been taken, the medium containing the isotopic analogs is prepared. The medium from the culture is removed and, replaced with one containing the isotopic chemical analogs and then incubated. Following incubation, the cells are lysed. The lysate is collected and purified.
After purification, proteins are resolved using SDS-PAGE and then transferred to a PVDF membrane. Autoradiography is performed by exposing the membrane to x-ray film and measured using a phosphor imager. Western blotting is used to measure relative protein levels in the PVDF membrane. In this example the phosphorylation levels of leucine-rich repeat kinases synthesized in 293T cells were measured. The autoradiogram shows how much phosphorous was incorporated into the protein. Western blotting elucidates the levels of the LRRK proteins. Image analysis software is used to obtain quantitative data of phosphorylation levels of the proteins.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
In this next procedure, photoreactive labeling is demonstrated. First, the cells are prepared and cultured. The photoreactive analog is added to the cells at the mid-log phase and incubated. In this procedure p-benzoylphenylalanine is used. Samples are collected over intervals and put on ice. The samples are then exposed to obtain snapshots of the biochemical pathways over time. The proteins of interest are then purified and resolved using SDS-PAGE.
A photoreactive labeling strategy was used to identify compounds that interact with the protein of interest. Immunodetection with Western blotting shows protein bands that indicate higher molecular weight proteins are present in the irradiated samples. These are from cross-linking due to protein-protein interaction occurring during the UV irradiation.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_4">
Now that we&#39;ve reviewed metabolic labeling procedures, let&#39;s look at some of the ways the process is used.
Metabolic labeling concepts can be extended to multicellular organisms. Plants are grown in a sealed environment, rich in stable isotopes to produced labeled plant material. Carbon dioxide containing carbon-13 is added to the enclosure, while nitrogen-15 rich fertilizer is used. The resulting harvested plant material can help answer questions about carbon and nitrogen cycling from the ecosystem.
Labeling enables the separation of newly synthesized RNA from older RNA. By changing the initial concentration of analog, the kinetics of new RNA synthesis can be determined. The results show that the concentration of 4-thiouridine affects how much new RNA is transcribed. Additionally, incorporation rates of the label into RNA can be directly quantified with a spectrophotometer.
Using biorthogonal click chemistry, glycans in a zebra fish embryo can be labeled. The eggs are injected with a labeling compound that results in alkyne labels on the glycans. The glycans in the larvae are then ligated to a dye compound at the desired development stage. The glycans in the embryos are then imaged. Glycans produced at different time points can be identified by labeling using different colors at different stages of embryo development.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_5">
You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on metabolic labeling. This video described the concepts behind metabolic labeling and their strategies, went over two general procedures, and covered some of the uses of the techniques.
Thanks for watching!
</div>

Isotopic, Photoreactive and Bioorthogonal Metabolic Labeling

תיוג מטבולי

Metabolic labeling is used to probe the biochemical transformations and modifications that occur in a cell. This is accomplished by using chemical analogs ...

להמחיש Lignification Dynamics בצמחים עם לחץ על כימיה: תיוג כפולה היא האושר!

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

שילוב ראמאן הדמיה ניתוח רב משתנים לדמיין ליגנין, תאית, ו Hemicellulose בקיר תא צמחים

מדידת אינטראקציות בין הפלורסנט לליגנין בסעיפים צמחיים על ידי sFLIM בהתבסס על מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מקורית

ללא תווית באתרו הדמיה של Lignification בתוך קירות התא הצמח

הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר של דינמיקה של דופן התא באמצעות calcofluor ב-Moss Physcomitrium patens

הכתמה histochemical של

הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית עם כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה

הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית עם כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה

הדמיה של סיאלילציה תוך-תאית עם כימיה של קליק ומיקרוסקופ הרחבה

תיוג מטבולי