أنجز هذا العمل بالدعم من منحة، 5R21HD080684-02، من المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية. المؤلف يود أن يشكر شو كين للحماس المتواصل ودعمه. صاحب البلاغ أيضا تود أن تقر بلومبرغ بروس لاستخدام آلة التصوير، "ربيكا شارني"، لقراءة نقدية للمخطوطات، وشون مكنمارا ومارسين وليزلا في المورد النمو الوطني (RRID:SCR_013731)، لقيمة المحادثات المتعلقة بتغذية X. tropicalis ونظم الرعاية الحيوانية.

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها لجنة الاستخدام من جامعة كاليفورنيا في إيرفين ورعاية الحيوان المؤسسية.
1-الأعمال التحضيرية لزرع PGC
<ol><li>إعداد أدوات تشريح مسبقاً، كما هو موضح سابقا23. ملاحظة: يتم استخدام السكاكين شعر الحواجب جعل شقوق بالمساعدة من حلقة الشعر استقرار الجنين أثناء إجراء العمليات الجراحية. الشعر الحاجب والشعر الحلقات لصقها في زجاج البورسليكات باستور الممصات التي قد وضعت أولاً في لهب وكسر في الجزء ضعفت (انظر الشكل 1A، رأس السهم) لإنشاء تلميح أقصر وأضيق (الشكل 1B) لمهارة أكبر عند إجراء العمليات الجراحية.</li>
	<li>إنشاء سجرناس باستخدام الإجراءات الموصوفة سابقا24 . ملاحظة: بإيجاز، قصيرة الحمض النووي الترميز سجرناس يتم إنشاء قوالب باستخدام ديوكسيوليجونوكليوتيديس المتداخلة التي تحتوي على "ملء" و 5 ' عاثية T7 المروجين، التي هي تعتيق بوليميراز الدنا خالية من الأخطاء، والحرارة. في المختبر سجرنا التوليف التفاعلات هي المحتضنة لعدة ساعات بين عشية وضحاها (اعتماداً على عدة المستخدمة). ردود الفعل المعالجة الدناز لإزالة القالب. يتم تنقيته سجرناس بالأساليب القياسية للفينول/كلوروفورم الاستخراج والأمونيوم اسيتات/الايزوبروبانول هطول الأمطار، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة مجموعة24.</li>
	<li>قبل وقت قصير من أداء ميكروينجيكشنز، إعداد مجمعات سجرنا Cas9 بأول يشوه ~ 250 نانوغرام سجرنا في ميليلتر 3 إجمالي حجم رناسي خالية (المعالجة ديثيلبيروكاربوناتي) ح2س في 60-65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تليها التبريد السريع على الجليد لمدة 5 دقائق. الطرد المركزي في سجرنا لبضع ثوان وإضافة 1 ميليلتر من 1 ميكروغرام/ميليلتر Cas9 البروتين واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتعزيز تشكيل معقدة. ملاحظة: بعد هذا الاحتضان، الأنبوب يمكن الاحتفاظ على الجليد بينما كان يستعد الأجنة ل microinjection.</li>
	<li>الحصول على X. tropicalis الأجنة عن طريق الإخصاب في المختبر باستخدام الأساليب القياسية، كما هو موضح سابقا25. إزالة جيلي،من2526 الأجنة في إخصاب بعد 10 دقائق. ملاحظة: يعتبر وقت الإخصاب الوقت بعد تعليق الحيوانات المنوية إضافة للبيض والطبق طوفان 1/9thX مارك قارعو الأجراس تعديل (MMR)26. لإجراء X. tropicalis25، خلافا X. laevis، في جيليينج دي في 1/9 x MMR التي تحتوي على 3% سيستين مجاناً قاعدة (لا الملح HCl)، الأس الهيدروجيني تعديلها إلى 7.8-8.0، تليها يغسل المتعددة في 1/9 x MMR. نقل الأجنة إلى [اغروس] (1%)-طبق المغلفة التي تحتوي على 1/9 x MMR في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>نقل الأجنة بالحقن لطبق [اغروس] المغلفة 1% الذي يحتوي على 1 على الفور x MMR باستخدام ماصة باستور.</li>
	<li>
حقن في المرحلة 1-الخلية. راجع مراجع26،27 أوصاف مفصلة لأساليب microinjection النمو .
	<ol>
<li>حقن كل الأجنة في موقع واحد في القطب الحيواني، مع 4 nL مجمع Cas9-سجرنا (المبلغ النهائي = 1 نانوغرام Cas9 وجزء من الغرام ~ 250 من سجرنا؛ انظر المناقشة)24. بعد 10-20 دقيقة لحقن الموقع الشفاء، نقل الأجنة طبق [اغروس] المغلفة التي تحتوي على 1/9 x MMR واحتضان عند 25 درجة مئوية. أيضا إنشاء طبق من الأخوة أونينجيكتيد الأجنة التي ستكون بمثابة متلقي الاختلاس.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إعداد لوحات بيتري (60 ملم) التي تحتوي على مم ~ 5-طبقة سميكة من 1% [اغروس] في 0.3 x MMR، إذا كان القيام بعمليات الزرع في X. tropicalis، أو 1 x MMR ل X. laevis.
	<ol>
<li>إنشاء المنخفضات ~ 3-4 مم العميقة بإدراج 3-x 4-البئر العفن (تم إنشاؤه عن طريق خفض صفيحة بكر 96-جيدا) في المنصهرة [اغروس] عند سكب اللوحات (انظر الشكل 1 و دال). عقد العفن عدة ملليمترات فوق الجزء السفلي من صحن بيتري استخدام المشبك تعلق على موقف خاتم حتى قد تصلب [اغروس].</li>
		<li>بالإضافة إلى ذلك، جعل لوحة 24-جيدا للأجنة الفردية بيت بطلاء الآبار مع طبقة رقيقة من 1% [اغروس] في 1/9 x MMR. ملاحظة: هو المتوسط الثقافة إضافة إلى هذه الآبار x 1/9 MMR تستكمل مع 50 ميكروغرام مع الجنتامايسين كبريتات/مل.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-زرع بجكس
<ol><li>عند الأجنة فقط الوصول إلى نيووكوب وإبر28 البلاستولا المرحلة 9 (الشكل 2A)، ح ~4.5 بعد الإخصاب (hpf) ل X. tropicalis، إزالتها من حاضنة 25 درجة مئوية، والسماح لهم بحجته إلى درجة حرارة غرفة إضافية ح 0.5.</li>
	<li>للبدء زرع 5 هبف (الشكل 2)، استخدم ماصة باستور نقل أحد الأجنة المانحة PGC (حقن Cas9-سجرنا) للطبق [اغروس] 60 ملم تحتوي على منخفضات (تم إنشاؤه في الخطوة 1، 7) في 0.3 x MMR (أو 1 x MMR في حالة استخدام X. laevis). كما نقل أحد الأخوة أونينجيكتيد الجنين، المستلم الاختلاس، لهذا الطبق. ملاحظة: من المهم أن لا يتم الخلط هويات كل من هذه الأجنة.</li>
	<li>يدوياً إزالة المغلفات فيتيلين من كل الأجنة باستخدام الملقط وتدوير كل الأجنة حيث تكون أقطاب فيجيتال بهم في العرض ويمكن الوصول إليها لإجراء عملية جراحية. ملاحظة: وصف فيتيلينيشن دي اليدوي من الأجنة قد سبق وصف26.</li>
	<li>استخدام تلميح حادة سكين الشعر الحاجب، جعل أربعة شقوق ضحلة على شكل مربع في القطب فيجيتال الجنين المتلقية، داخل المنطقة حيث سوف تشكل الخلايا زجاجة مستقبلا بوضع علامة بلاستوبوري. جعل الشقوق بإدراج غيض السكين شعر الحاجب في الجنين، فقط تحت السطح، وجعل التصاعدي تقطيع الحركات حين استقرار الجنين مع حلقة الشعر. ملاحظة: يبين الشكل 2 آراء نباتية للجنين على فترات التابع من 4.5 7.0 هبف لإظهار حجم الخلية وتوفير دليل لتقدير حيث ستشكل الخلايا الزجاجات (دائرة بيضاء متقطع). والهدف جعل شقوق حيث تتم الإشارة إلى مربع أسود متقطع.</li>
	<li>حالما يتم تحدد الجوانب الأربعة للمربع شقوق، تعميق كل شق بالسكين شعر الحاجب استخدام الاقتراحات قطع مماثلة للوصول إلى عمق من حوالي 1/3 إلى 1/2 المسافة إلى الكلمة blastocoel.</li>
	<li>مجاناً explant الأنسجة النباتية من الجنين المتلقية (الشكل 3 ألف و ب) بجعل أفقي (الموازية للسطح النباتي) cut(s) في منطقة نباتية عميقة. ملاحظة: هو حجم explant النباتية المحتوية على PGC حوالي 0.4-0.45 ملم من كل جانب و 0.25-0.3 ملم في العمق. لم يعد هناك حاجة هذا explant نباتية من الجنين المتلقي وينبغي لذلك جانبا لإهمالها.</li>
	<li>العمل بسرعة، كرر هذا الإجراء (خطوات 2.4-2.6) على الجنين PGC المانحين إنشاء جزء حجم وبالمثل أنسجة نباتية لزرع الأعضاء. ملاحظة: من المهم الاضطلاع بهذا التشريح الثاني مع القليل من التأخير لتقليل الوقت للجنين المتلقية للشفاء جرح مفتوح.</li>
	<li>حالما تتم إزالة الأنسجة التي تحتوي على بجكس من الأجنة المانحة، استخدام حلقة السكين وحلاقة الشعر الحاجب لنقل هذا اكسبلانت إلى الموقف في افتتاح إنشاؤها في الجنين المتلقية. ملاحظة: يجب أن تواجه السطح الداخلية للاختلاس المانحة الداخلية للجنين المتلقية. فإنه ليس من الضروري لمطابقة لتوجهات المحاور الظهرية البطني واليسار واليمين للاختلاس مع الجنين المتلقية.</li>
	<li>استخدام الحافة الطويلة رمح السكين شعر الحاجب، الذي عقد موازيا لسطح الابتزاز، لاضغط برفق الاختلاس في الافتتاح في السطح النباتي الجنين المتلقية.</li>
	<li>مرة واحدة وضعت الاختلاس، استخدام هايرلوب أو مدخل المنجم سكين شعر الحواجب للشريحة بلطف "الذبيحة" الجنين المانحة عبر السطح [اغروس] وإلى اكتئاب [اغروس]. تأكد من أن تواجه جرح مفتوح من الذبيحة السائل الأكبر. إذا لم يكن الأمر كذلك، استخدم السكين شعر الحواجب لتدوير الجنين إلى تحقيق هذا التوجه.</li>
	<li>الشريحة الجنين المتلقية، مع الاختلاس الشفاء في المكان، إلى اكتئاب المتاخمة وكذلك التأكد من أن تواجه الأنسجة المطعمة فيجيتال القطب السائل الأكبر.</li>
	<li>كرر هذا الإجراء (خطوات 2.1-2.11) باستخدام زوج آخر من البلدان المانحة والمتلقية من الأجنة لإنشاء زوج زرع/الذبيحة آخر؛ نقل هذه المنخفضات فارغة. ملاحظة: من الأهمية بمكان واحد يجعل تدوينات لتعقب أزواج متماثلة من الذبائح والحاملة لزرع الأجنة. جيف المانحين ستستخدم كوكيل للكفاءة للطفرات التي يسببها سجرنا Cas9 في بجكس المزروعة، التي لا يمكن أن تكون بسهولة جزيئي حتى الحيوانات الحاملة لزرع تصل إلى مرحلة النضج الجنسي (راجع الخطوة 3-3، أدناه، و مناقشة ).</li>
	<li>مواصلة إجراء عمليات زرع الأعضاء حتى تصل الأجنة إلى مرحلة gastrula مبكرة حوالي 10، وهو ما يقرب من 6.5 هبف في X. tropicalis (انظر الشكل 2E).</li>
</ol>3-بعد شفاء رعاية الأجنة
ملاحظة: شفاء الطعوم في مكانها داخل ~ 30 دقيقة، ومن الطبيعي أن نلاحظ بعض الحطام yolky من تحلل الخلية تنزح من الجنين (الشكل 3).
<ol><li>
عندما تلتئم، استخدام ماصة باستور إلى بلطف جداً نقل الأجنة من المنخفضات إلى الآبار الفردية من صفيحة 24-جيدا [اغروس] المغلفة. سوف تكون الإفرازات إزالتها (الشكل ثلاثي الأبعاد) بخلط أثناء النقل السوائل.
	<ol>
<li>قم بتدوير الأجنة حيث أن وضعها نباتية القطب حتى تواجه الحل الأكبر. مرة أخرى، ضع جيف المانحين و graft المستلمين في الآبار المجاورة للمساعدة في اقتفاء أثر أزواج الجنين؛ تسجيل هذه المعلومات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>نقل لوحة 24-كذلك تحتوي على الأجنة لحاضنة 25 درجة مئوية للثقافة بين عشية وضحاها. ملاحظة: في اليوم التالي، الأجنة سوف وصلت إلى مراحل تايلبود.</li>
	<li>نقل المستلمين الابتزاز لتنظيف لوحات 6-جيدا [اغروس] المغلفة التي تحتوي على 1/9 x MMR تستكمل مع 50 ميكروغرام مع الجنتامايسين كبريتات/مل، مع الجنين 1 كل بئر. الاحتفاظ بسجل واضح لجثث الجهات المانحة التي تطابق هذه graft المستلمين.</li>
	<li>لتقييم كفاءة الطفرات بتسلسل بكر أمبليكونس5،،من1724 أو باستخدام الأساليب الأخرى التي تعتمد على أمبليكونس بكر (انظر المناقشة)، نقل جثث الفردية إلى 0.2 مل PCR قطاع أنابيب. إزالة أكثر من المتوسط وتجانسه في تحلل 100 ميليلتر المخزن المؤقت24 تتضمن بروتيناز ك (PK) بتكرار بيبيتينج صعودا ونزولاً باستخدام ماصة P200.</li>
	<li>إجراء تحلل الجنين24 في 56 درجة مئوية ل 6 (ح) بين عشية وضحاها إلى تصريح الهضم PK. إلغاء تنشيط PK بتدفئة 90-95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، متبوعاً بالتبريد السريع إلى 4 درجات مئوية. استخدام ليساتيس دون مزيد من خطوات تنظيف للبذور PCR ردود الفعل للحصول على أمبليكونس قصيرة ل تسلسل "الحمض النووي سانجر" مباشرة24. تخزين ليساتيس في-20 درجة مئوية. ملاحظة: في غضون عدة أيام، سوف تصل إلى مراحل التغذية (المرحلة حوالي 45-46) الضفادع الصغيرة ويمكن تغذية تعليق مسحوق العوالق (الأمصال ميكرون).</li>
	<li>بعد أسبوع ~ 1، مع التغيرات اليومية للثقافة المتوسطة الحفاظ على نظافة والتقليل من فرط الميكروبية، نقل الضفادع الصغيرة إلى خزانات صغيرة في تعميم نظام المائية مع تدفق بالتنقيط. استخدام البيانات التسلسل لفصل الضفادع الصغيرة مع بجكس موتاجينيزيد عالية الكفاءة من الضفادع الصغيرة مع انخفاض كفاءة الطفرات. بمجرد اكتمال المسخ، نقل الضفيدعات نظام المائية الكبار في المختبر. ملاحظة: أنظمة وضعتها المورد النمو الوطني (مختبر البيولوجيا البحرية، وودز هول، ماجستير) تقديم دليل شرغوف التغذية29 والضفدع الكبار صيانة30.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gurdon, J. B., Hopwood, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+introduction+of+Xenopus+laevis+into+developmental+biology:+of+empire,+pregnancy+testing+and+ribosomal+genes.">The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes.</a> Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).</li><li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li><li>Session, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+in+the+allotetraploid+frog+Xenopus+laevis.">Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis.</a> Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).</li><li>Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biallelic+genome+modification+in+F(0)+Xenopus+tropicalis+embryos+using+the+CRISPR/Cas+system.">Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system.</a> Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).</li><li>Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+RNA/Cas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li><li>Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+Xenopus+laevis+using+CRISPR/Cas9.">Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9.</a> Cell Biosci. 5, 15 (2015).</li><li>Jaffe, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c21orf59/kurly+Controls+Both+Cilia+Motility+and+Polarization.">c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization.</a> Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+of+genes+involved+in+neural+crest+development+using+the+CRISPR/Cas9+system+in+Xenopus+embryos.">Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos.</a> Cell Biosci. 6, 22 (2016).</li><li>Naert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+knockout+of+rb1+and+rbl1+leads+to+rapid+and+penetrant+retinoblastoma+development+in+Xenopus+tropicalis.">CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis.</a> Sci Rep. 6 (35264), (2016).</li><li>Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Xenopus+laevis+F1+albino+J+strain+by+genome+editing+and+oocyte+host-transfer.">Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer.</a> Dev Biol. 426 (2), (2016).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Shigeta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+analysis+of+gene+function+using+CRISPR-Cas9+in+Xenopus+tropicalis+founders.">Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders.</a> Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).</li><li>Hontelez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+transcription+is+controlled+by+maternally+defined+chromatin+state.">Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state.</a> Nat Commun. 6, 10148 (2015).</li><li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Relationship+of+Protein+and+mRNA+Dynamics+in+Vertebrate+Embryonic+Development.">On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development.</a> Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).</li><li>Owens, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Absolute+RNA+Copy+Numbers+at+High+Temporal+Resolution+Reveals+Transcriptome+Kinetics+in+Development.">Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development.</a> Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).</li><li>Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leapfrogging:+primordial+germ+cell+transplantation+permits+recovery+of+CRISPR/Cas9-induced+mutations+in+essential+genes.">Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes.</a> Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).</li><li>Blackler, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+germ-cells+in+Xenopus+laevis.">Transfer of germ-cells in Xenopus laevis.</a> Nature. 185, 859-860 (1960).</li><li>Blackler, A. W., Fischberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+primordial+germ-cells+in+Xenopus+laevis.">Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis.</a> J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).</li><li>Bounoure, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , (1939).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , (1979).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules.">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools.">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-based+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).</li><li>Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+transgenesis+in+Xenopus+using+I-SceI+meganuclease.">High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , (2000).</li><li>Kay, B. K., Kay, B. K., Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+oocytes+and+embryos.">Injection of oocytes and embryos.</a> Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). , (1991).</li><li>Nieuwkoop, P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. , (1994).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Res. 42 (22), e168 (2014).</li><li>Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opposing+homeobox+genes+Goosecoid+and+Vent1/2+self-regulate+Xenopus+patterning.">The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning.</a> EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system.">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+with+CRISPR-Cas-derived+RNA-guided+endonucleases.">Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases.</a> Nat Commun. 5, 3157 (2014).</li><li>Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+cells+with+zinc+finger+nucleases+constructed+via+modular+assembly.">Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly.</a> Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).</li><li>Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+detection+using+Surveyor+nuclease.">Mutation detection using Surveyor nuclease.</a> Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).</li><li>Ota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+identification+of+TALEN-mediated+genome+modifications+using+heteroduplex+mobility+assays.">Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays.</a> Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).</li><li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Methods+for+Generating+and+Detecting+Locus-+Specific+Mutations+Induced+with+TALENs+in+the+Zebrafish+Genome.">Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).</li><li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+CRISPR/Cas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis.">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci Rep. 5, 15587 (2015).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+Based+Protocol+for+Detecting+Indel+Mutations+Induced+by+TALENs+and+CRISPR/Cas9+in+Zebrafish.">A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish.</a> PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).</li><li>Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+to+assess+gene-editing+frequencies+(GEF-dPCR)+mediated+by+designer+nucleases.">Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases.</a> Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elr-type+proteins+protect+Xenopus+Dead+end+mRNA+from+miR-18-mediated+clearance+in+the+soma.">Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).</li><li>Yang, J., Aguero, T., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+maternal-to-zygotic+transition+from+the+perspective+of+the+germline.">The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline.</a> Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).</li></ol>

ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.

ويقدم هذا التقرير يستخدم بروتوكول مفصل لزرع الأنسجة النباتية التي تحتوي على بجكس-"زرع الأعضاء من بجكس" بالتزامن مع تحرير الجينوم التكنولوجيات (مثل، كريسبر/Cas9) لتعديل الفعل حيوان بينما الحفاظ على ما يقرب من جميع الأنسجة الجسدية، كنوع البرية وراثيا. لتجاوز المراحل لتكون ناجحة، هناك عد?...

وقد كيف بالنمط الوراثي ترميز النمط الظاهري مسألة رئيسية في علم الأحياء منذ إعادة اكتشاف قوانين مندل. فهم أدوار الجينات وتنظيمها والتفاعلات داخل شبكات الجينات، ووظائف المنتجات المشفرة بالوعود تقديم أدوات للكشف عن الأحياء الجديدة وتحسين المرض الدول. لأكثر من نصف قرن1، كان الضفدع الأفريقية المخالب، النمو، نموذجا رائدا للدراسات بشأن طائفة واسعة من المواضيع في البيولوجيا الأساسية والطب الحيوي، بما في ذلك عنصر التحكم الوراثي للتنمية. تاريخيا، استخدمت معظم البحوث بشأن النمو الضفدع اللوتيترابلويد، X. laevis، ولكن في الآونة الأخيرة، وضعت بسبب ما ديبلويدي، X. tropicalis كنموذج وراثية البرمائية. وقد تم تجميع تسلسل الجينوم الكامل من كل الأنواع النمو 2،3. "المجتمع الضفدع" الآن في نقطة تحول حيث تسمح تقنية تعديل الجينوم الأساسي دراسة وظيفة الجينات، وتقريبا في الإرادة. برمجة كريسبر/Cas9 اندونوكليسيس جعلت الطفرات الجينات ذات كفاءة عالية، مع الطفرة بياليليك ممكن في معظم الخلايا الحيوانية4،5،،من67، 8،9،،من1011. هذه الدراسات، وأبرز بهاتاشاريا et al. 12 وشيجيتا et al. 13، قد أظهرت أن الدالة العديد من الجينات يمكن أن يدرسها الطفرات في و0 فسيفساء الحيوانات. وهذا النهج له العديد من المزايا؛ ومع ذلك، عرض الأجنة Cas9-سجرنا-ميكروينجيكتيد غالباً ما تعمل متغير بسبب فقدان وظيفة (LOF) غير مكتملة. الأهم من ذلك، توليد خطوط متحولة مفيد جداً لبعض التطبيقات – وبخاصة عند دراسة الجينات التي لها مساهمة مرناً النفاسية. مرناس الأمهات والبروتينات، وتأثيراتها على التخلق، تستمر لفترة طويلة في امبريوجينيسيس14،،من1516، تقديم المساهمات الإنمائية المبكرة العديد من الجينات صهر للتحليلات و0 . ولذلك، نهج LOF أخرى مطلوبة.
عندما تسعى إلى إنشاء خطوط متحولة، والمسار للحصول على الأجنة LOF متماثل قد عدة عقبات. يمكن أن تكون الطفرات أولاً، تتسم بالكفاءة لإنتاج طفرات بياليليك غير ملائم نظراً لفقدان وظائف الجينات الأساسية يؤدي إلى الفشل في البقاء على قيد الحياة إلى مرحلة النضج الجنسي، تتداخل مع إنتاج خط قابلة للحياة. حل مشترك هو المعايرة الدقيق مقدار Cas9-سجرنا تسليمها. هنا، أن الهدف تحقيق توازن بين خفض الفتك مع تعظيم كفاءة الطفرات germline أيضا. ظهرت مشكلة ثانية من نظام تربية قياسية، حيث يتم تأجيل تحليلات المظهرية إلى الجيل2 و. استخدام النهج الموحدة، ناضجة جنسياً و0 الحيوانات التي تنقل المسخ الآليلات من خلال الخط يتم أووتكروسيد لإنتاج و1 متخالف "ناقلات"، التي تزرع ثم إلى مرحلة النضج الجنسي. ثم يتم إينتيركروسيد اثنين heterozygotes1 و إنتاج و2 أجنة المسخ في تردد مندلية المتوقعة بنسبة 25%. وهكذا، جيلين تربية ضرورية لتحليل تعمل المسخ. يمكن أن تكون الحيوانات المسخ homozygotes أو heterozygotes المركب (أي ذرية تحتوي على اثنين من الآليلات المختلفة المسخ، الذي يعتمد على الأنماط الجينية للحيوانات الأبوية المستخدمة في إينتيركروس1 و).
ويمكن التغلب على هذه العقبات بقصره للبرمجة نوكلاس بوساطة الطفرات في الخلايا الجرثومية، الذي يكمن وراء طريقة جديدة تسمى الوثب17. قفزات واسعة بعنصرين رئيسيين هما: (1) microinjection مرناً Cas جنبا إلى جنب مع سجرنا، أو مجمعات سجرنا nuclease (أو في مبدأ أو تالينس أو الزنك nucleases الإصبع) مرحلة وحيدة الخلية كفاءة موتاجينيزي الجينوم الجنينية، تليها (2) زرع بجكس إلى أجنة الأخوة wildtype، حيث أزيلت بجكس الذاتية. يمكن الحصول على كل الخطوات عند استبدال الخط كاملة، وكفاءة مع الخلايا الجرثومية المسخ. أظهر بلاكلير في أوائل الستينات أن يمكن زرع بجكس النمو بين الأجنة في نارولا الراحل وأوائل تايلبود مراحل18،19. للقفزات، تعديل النهج الذي بلاكلير بالقيام عمليات الزرع في مرحلة البلاستولا17، عندما يتم ترجمة بجكس في القطب فيجيتال20،الجنين21. وقد زرع قبل gastrulation اثنين من المزايا الرئيسية. أولاً، تم العثور على انجرافتمينت لعمليات زرع الأعضاء والتطور الطبيعي اللاحقة لتكون أكثر فعالية عندما يتم زرع الأعضاء في مرحلة البلاستولا (الملاحظات غير منشورة). ثانيا، عن طريق إجراء عمليات الزرع في مرحلة البلاستولا بعد وقت قصير من النسخ زيجوتيك وقد بدأ، واحد تجنب الفتك الناشئة عن الجينات الإنمائية الطفرات التي تعطل gastrulation أو خلاف ذلك يؤدي إلى تالف نارولا أواخر. وتزرع PGC الحاملة لزرع الأجنة ("تخطي") إلى مرحلة النضج الجنسي، وإينتيركروسيس بين هذه الحيوانات0 و قد أثبتت أنه في كثير من الحالات، عرض 100 ٪ ذرية1 و النمط الظاهري LOF (معظم يجري مجمع heterozygotes)، التي تشير إلى استبدال الخط كاملة مع التحولات المستهدفة.
ومن المتوقع أن القفزات سوف تعجل بالنهج الوراثية في النمو. قفزات واسعة كما يوفر بديلاً ل أسلوب "مضيفة نقل"22 لتحليل LOF للأمهات تأثير الجينات (الملاحظات غير منشورة). في المنشور الحالي، يرد وصف مفصل للطريقة، وتركز بصفة خاصة على زرع PGC، في X. tropicalis (مع تعديلات طفيفة ل X. laevis). ويتجلى زرع بجكس هنا لتسهيل نقل هذه التكنولوجيا أكثر سرعة إلى مختبرات أخرى تعمل مع النمو. ينبغي أن تكون مبادئ هذا الأسلوب الناجح في البرمائيات الأخرى (مثلاً، أوروديليس)، والتعديلات الخاصة بالكائن الحي في المنهجية التي ينبغي أن تسمح بالتطبيق للعديد من الحيوانات الأخرى التي يمكن تحقيق كفاءة الطفرات و بجكس سهولة الأولى.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20 or 11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Eyebrow hair knife</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Hair loop</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes, borosilicate glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)</td><td>Elmer&#039;s Products, Inc.</td><td>KG581</td><td>To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.</td></tr><tr><td>Oligodeoxynucleotides, custom ordered</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom ordered</td><td>Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.</td></tr><tr><td>Megascript T7 kit</td><td>Ambion/ThermoFisher</td><td>AM1334</td><td>Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit</td></tr><tr><td>Phenol, Tris buffered</td><td></td><td></td><td>High quality distilled phenol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td></td><td></td><td>High quality chloroform from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>High quality ethanol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>D5758-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 protein, with nuclear localization signal</td><td>PNA Bio, Inc.</td><td>CP01</td><td>Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer&#039;s recommendations</td></tr><tr><td>10X Marc&#039;s Modified Ringers solution</td><td></td><td></td><td>Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td>Any Molecular Biology grade agarose is sufficient</td></tr><tr><td>60 X15 mm Petri plates</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Falcon</td><td>3047</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>C7352-100G</td><td>Free base, not HCl salt</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03 115 828 001</td><td>Typically ~20mg/ml from Roche</td></tr><tr><td>sera Micron</td><td>sera</td><td></td><td>Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers</td></tr></tbody></table>

primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus

هو التعجيل بإنشاء خطوط متحولة عن طريق تحرير الجينوم التحليل الجيني في العديد من الكائنات الحية. أساليب كريسبر/Cas9 وقد تم تكييف للاستخدام في الضفدع المخالب الأفريقية، النمو، كائن طراز القديم للبحوث الطبية الحيوية. وقد نظم التربية التقليدية لخلق خطوط متحولة متماثل مع الطفرات كريسبر/Cas9--استهدفت عدة خطوات شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً. تيسيرا تخليق أجنة متحولة، لا سيما التغلب على العقبات المرتبطة بانقطاع الجينات التي لا غنى عنها ل embryogenesis، وضعت طريقة جديدة تسمى قفزات واسعة. هذا الأسلوب روافع متانة النمو الأجنة "قص ولصق" أساليب الجنينية. قفزات واسعة يستخدم نقل الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) من الأجنة موتاجينيزيد كفاءة الجهات المانحة إلى الأخوة والأخوات أبلاتيد PGC wildtype. يسمح هذا الأسلوب للطفرة كفاءة الجينات الأساسية عن طريق إنشاء تشيميريك الحيوانات مع خلايا جسدية wildtype التي تحمل الفعل المسخ. عندما تقل اثنين من الحيوانات0 و "زرع قفز" هي إينتيركروسيد (أي، متحولة الخلايا الجرثومية)، وأنها تنتج متماثل، أو مجمع متخالف، فارغة و1 الأجنة، مما يوفر وقت جيل كامل للحصول على البيانات المظهرية. قفزات واسعة كما يوفر نهجاً جديداً لتحليل الجينات تأثير الأم، التي صهر لتحليل المظهرية0 و بعد الطفرات كريسبر/Cas9. هذه المخطوطة تفاصيل أسلوب القفزات، مع التركيز بوجه خاص على كيفية إجراء زرع PGC بنجاح.

عقب الزرع، ينبغي أن يجري تحديد النوعية لكفاءة الطفرات كريسبر/Cas9 قبل أنفاق الجهد في تربية الحيوانات على النمو والحفاظ على الحيوانات لمرحلة النضج الجنسي. لأن الحيوانات تحمل زرع قفز سوماتيكالي wildtype والفعل يصعب الوصول إليها للقياسات المباشرة، يصبح من المهم إنقاذ جثث الأجن?...

Watch this Scientific Journal Video about Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus at JoVE.com

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

الجينات الأساسية للبقاء على قيد الحياة تشكل عقبات تقنية لإنشاء خطوط المسخ. قفزات واسعة تلتف الفتك بالجمع بين الجينوم التحرير مع زرع الخلايا البدائية خلق الحيوانات البرية من نوع تحمل طفرات الخط. قفزات واسعة ويسمح أيضا بكفاءة توليد طفرات فارغة متماثل في الجيل1 و. ويتجلى هنا، خطوة الزرع.

زرع الخلايا البدائية كريسبر/Cas9-تعتمد قفزات واسعة في النمو

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

primordial-germ-cell-transplantation-for-crisprcas9-based

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

8.3K Views.  University of California, Irvine. الجينات الأساسية للبقاء على قيد الحياة تشكل عقبات تقنية لإنشاء خطوط المسخ. قفزات واسعة تلتف الفتك بالجمع بين الجينوم التحرير مع زرع الخلايا البدائية خلق الحيوانات البرية من نوع تحمل طفرات الخط. قفزات واسعة ويسمح أيضا بكفاءة توليد طفرات فارغة متماثل في الجيل1...

Video: Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

التلاعب و<em&gt; في المختبر</em&gt; نضوج<em&gt; القيطم المورق</em&gt; البويضات، تلاه سهم داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية، لدراسة التطور الجنيني

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Developmental Biology

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

الخلايا الجذعية مثل<em&gt; القيطم</em&gt; الجنينية إإكسبلنتس إلى الدراسة في وقت مبكر العصبية التنموية الميزات<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

الاستنساخ وظيفية باستخدام<em&gt; القيطم</em&gt; نظام التعبير البويضة

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

كريسبر/Cas9-بوساطة التكامل المستهدفة في فيفو استخدام استراتيجية تستند إلى الانضمام إلى التماثل بوساطة نهاية

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as axolotls, to regenerate entire limbs as adults. Here, we outline techniques used to generate chimeric axolotls with Cas9-mutagenized haploid forelimbs that can be used for exploring gene function and the fidelity of limb regeneration. We combine several embryological and genetic techniques, including haploid generation via in vitro activation, CRISPR/Cas9 mutagenesis, and tissue grafting into one protocol to produce a unique system for haploid genetic screening in a model organism of regeneration. This strategy reduces the number of animals, space, and time required for the functional analysis of genes in limb regeneration. This also permits the investigation of regeneration-specific functions of genes that may be required for other essential processes, such as organogenesis, tissue morphogenesis, and other essential embryonic processes. The method described here is a unique platform for conducting haploid genetic screening in a vertebrate model system.

This goal of this protocol is to produce chimeric axolotls with haploid forelimbs derived from Cas9-mutagenized donor tissue using embryonic tissue grafting techniques.

جيل من الأناكسولوت الشيميري مع أطراف هابلويد متحولة من خلال التطعيم الجنيني

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

توليد الأجنة اسماك الزرد همي بواسطة زرع

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Biology

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

تسميد البويضات القيطم باستخدام أسلوب نقل المضيف

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

إنتاج المعدلة وراثيا القيطم المورق عن طريق تقييد أنزيم التكامل وساطة وزرع النووية

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an oocyte by a spermatozoon creates a totipotent zygote. Recently, several publications have reported that haploid embryonic stem cells (haESCs) can be a substitute for gametic genomes and contribute to embryos, which develop into mice. Here, we present a protocol to apply parthenogenetic haESCs as a substitute of sperm to construct embryos by intracytoplasmic injection into oocytes. This protocol consists of steps for preparing haESCs as sperm replacement, for injection of haESC chromosomes into oocytes, and for culture of semi-cloned embryos. The embryos can yield fertile semi-cloned mice after embryo transfer. Using haESCs as sperm replacement facilitates genome editing in the germline, studies of embryonic development, and investigation of genomic imprinting.

This article aims to demonstrate the use of parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute for sperm for the construction of semi-cloned embryos.

تطبيق الماوس البارثينوجينيك Haploid الخلايا الجذعية الجنينية كبديل للحيوانات المنوية

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

زرع الخلايا البدائية كريسبر/Cas9-تعتمد قفزات واسعة في النمو

Summary

Explore More Videos

التلاعب و

الخلايا الجذعية مثل

الاستنساخ وظيفية باستخدام