ברצוננו להודות ד&quot;ר איין Drummond וד&quot;ר ולדימיר Korzh לשיתוף כליה GFP כליה מהונדס. כמו כן, ברצוננו להודות ל- NYITCOM על אספקת המשאבים הדרושים לביצוע עבודה זו. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים: K08DK082782, R03DK097443 (NIH), ומענק פיילוט HSCI (AV).

מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות במדריך לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי המכללה NYIT של אוסטאופתיה רפואה מוסדית טיפול בבעלי חיים ועדת השתמש (NYITCOM IACUC). כל הניתוחים ובניסויים ב- vivo בוצעו תחת הרדמה טריקאין, וכל המאמצים נעשו כדי למזער את הסבל. 1. קבלה ושמירה על עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השגת עוברי ידי מעבר הכליה GFP ניאון דג הזברה. הערה: דוגמאות של קווי דג הזברה שכותרתו fluorescently שכותרתו המפורטים בטבלה 1 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העוברים ב 28.5 מעלות צלזיוס פתרון E3 במהלך 24 שעות לאחר ההפריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, להחליף את המדיום עם פתרון E3 המכיל 0.003% 1-phenyl-2-thiourea (PTU). הערה: PTU משמש מכיוון שהוא חוסם את השלבים התלויים בטירוזינאז במלנוגנזהולכן מונע פיגמנטציה. הנה, פתרון זה נקרא E3-PTU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות את עוברי מופרות ב 28.5 מעלות צלזיוס עד שהם&gt; 6 dpf, באיזו נקודה הכליות התבגרו. הערה: מומלץ להשתמש בזחלים בחלון 7-7 dpf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח בהגדלה 40X ומסננים פליטת הקרינה הירוקה, בחר את הזחלים עם הקרינה GFP הקרינה בכליה. </li></ol> 2. הרכבה דג הזברה עבור הדמיה חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם photoablating העוברים לפני dpf 3, להסיר את הסיסית מכל דג הזברה שלא נגזר לפני הרכבה דג הזברה עבור הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני dechorinate עם מלקחיים (המועדפת) או להשתמש בטיפול כימי עם תערובת פרוטאז. הערה: Dechorination מאפשרת את תוצאות ההדמיה הטובות ביותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את פסולת סיסית בצלחת פטרי באמצעות פתרון E3-PTU ולמלא את המנה עם E3-PTU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prepaמחדש 1-2% נמוכה נקודת התכה (LMP) agarose עם 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון tricaine לעלות את דג הזברה עבור photablation הכליות והדמיה חיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם agarose LMP כבר מוכן מראש, לחמם אותו במיקרוגל כדי להמיס אותו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose LMP מוכן, במקום צלחת פטרי 35 מ&quot;מ פלסטיק על מיקרוסקופ לנתח. מניחים זכוכית משכו בדיקה בקרבת מקום כדי לכוון כראוי את הזחלים הרדים. הערה: חשוב לעשות את זה צעד בזמן ו יש הכל במקום, כי העוברים חייבים להיות מכוונים לפני agarose מתקשה על 1-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני העברת העובר כדי agarose, ודא agarose הוא מגניב ( כלומר על טמפרטורת הגוף). השתמש פלסטיק או פיפטה העברת זכוכית למקם את העובר לתוך מתקתק מותך agarose-tricaine פתרון. הערה: זה נעשה בגלל agarose כי הוא חם מדי יכול להיות מזיק לעובר, המוביל דום לבאו מוות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה העברת, לצייר מחדש את העובר בפתרון agarose ומיקום העובר / זחל באמצע צלחת 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ במהירות agarose המכיל את העובר / זחל כדי לכסות באופן שווה את החלק התחתון של צלחת 35 מ&quot;מ; את עוצמת הקול הטובה ביותר של agarose להשתמש ~ ~ 1-1.1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחלון זכוכית כדי לכוון את העובר במצב הטוב ביותר האפשרי עבור photablation והדמיה. הערה: סרט 1 מציג את הכיוון הטוב ביותר של העובר / זחל עבור photablation חד צדדית. שלב זה הוא הזמן הרגיש ביותר צריך להתבצע במהירות לפני agarose מתחיל ג &#39;ל, כמו כל ניסיון reorient דגים לאחר gelling מתחיל מזיק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט הזחל כך קטע כליה של עניין הוא בניצב לנתיב קרן בעוד קטע הנגדי הוא הרחק קרן הלייזר (ראה סרט 1 ). הערה: זה יכול להיות מושגת על ידי הפיכת הזחל כפי שמוצג בסרט 1 . </lI </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר כ 15 דקות עבור agarose כדי לחזק. מכסים את צלחת פטרי כדי למזער אידוי. לאחר agarose יש solidified, העובר או הזחל מוכן photablation. </li></ol> 3. לייזר אבלציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מערכת הדמיה confocal. הערה: בעת שימוש בפלטפורמת ההדמיה הפניה (ראה טבלת החומרים), ההגדרות המומלצות כוללות הגדלה של 40X, עדשה לטבילה במים של 0.8 NA, והמראה הדיכרואי הראשון מוגדר על מנת לאפשר הן 488 &amp; 405 ננומטר תאורה של המדגם. האיתור צריך להתבצע על הערוץ הירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המנה המכילה את דג הזברה משותקת על הבמה confocal. הערה: הליך זה מותאם במיוחד לתצורה זקופה באמצעות עדשת טבילה במים 40-60X. עם זאת, זה צריך להיות אפשרי לשנות את ההליך עבור מיקרוסקופ הפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתצורה זקוף, למקם את צלחת פטרי המכיל את העובר על גבי מיקרוסקופשקופית ope ולשמור אותו במקום באמצעות חימר דוגמנות ( למשל, plasticine). מקמו את שקופית הזכוכית עם צלחת פטרי על הבמה של המיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של פתרון הדמיה E3-PTU (ראה שלב 1.3) עם 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​tricaine. הערה: פתרון הדמיה יכול גם להוסיף מיד לפני הנחת השקופית על הבמה. תוספת של פתרון הדמיה צריך להיעשות בזהירות רבה כדי למנוע agarose מרחף את התחתית של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לעדשת הטבילה במים (40 או 60X). לאט לאט להעלות את הבמה, ולוודא כי העדשה זווית מעט כדי למנוע את האוויר מלהיות לכודים בנתיב הקורה. כאשר העדשה נוגעת בפתרון בזווית, מרכז אותו כך שהוא נמצא בשדה הראייה של העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את הקטע של עניין באמצעות מקור אור פלואורסצנטי. מיקום שטחי של הענף המיועד לפגיעה כדי למזער את פיזור האור (ראה סרט 1 ). הערה: לאחר מכןT לעשות שימוש בתוכנות הפניה (ראה טבלה של חומרים), אבל הנוהל יכול להיות מותאם בקלות פלטפורמות אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנה. נווט אל &quot;הצג&quot; | &quot;בקרת רכש&quot; | &quot;C2plus קומפקט GUI&quot; ולהגדיר &quot;לשכון זמן פיקסל&quot; ל &quot;1.9 μs&quot;, &quot;גודל מסגרת&quot; ל &quot;512 x 512 פיקסלים&quot;, ו &quot;גודל חריר&quot; ל &quot;90 מיקרומטר&quot;. הגדר &quot;405 ננומטר (או 408 ננומטר במערכות מסוימות) עוצמת לייזר&quot; לאפס ו &quot;488 עוצמת לייזר&quot; ל &quot;נמוך&quot; (רצוי &lt;1%). להתאים את &quot;רווח&quot; כדי להשיג טווח דינמי טוב אבל לא להרוות את האות. הערה: ערכים אלה אינם קריטיים והם משמשים לעקביות. כאשר לייזר 405 ננומטר משמש, זה יגרום לעלייה הקרינה GFP. כדי למנוע את הרוויה של האות במהלך photobleaching (שלב 3.11), ערך רווח האות צריך להיות scaled למטה על הערוץ הירוק. הערוץ כחול הערוץ יכול להיות נשאר באפס, כפי שהוא אינו משמש עבור saדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;סרוק&quot; בממשק התוכנה כדי לסרוק את הכליה באמצעות לייזר 488 ננומטר. מצא את הקטע של עניין כי הוא מאונך לנתיב קרן וזה היטב visualized, עם הקרינה טוב GFP. לאחר אזור זה זוהה, לצייר אזור של עניין באמצעות אזור אליפטי של ריבית (ROI). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט אל &quot;החזר ROI&quot; &quot;צייר ROI אליפטית.&quot; הערה: זה ישמש ברציפות למדוד את עוצמת ה- GFP הממוצע בזמן photobleaching מתרחש, המאפשר ניהול של מנה מדויקת של טיפול בלייזר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט אל &quot;הצג&quot; | &quot;בקרות רכישה&quot; | &quot;C2plus Scan Area&quot; ובחר &quot;Band Scan Area&quot;. המסכה המלבנית תופיע בתוך ממשק זה. באופן ידני להגדיר חלון סריקה מלבני באמצעות הסמן ( כלומר גרור, לשנות גודל, ולהפוך את המסכה) כדי לכסות את הפלח ממוקד לייזר אבלציה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בתוךאזור המסכה כדי לקבל את הבחירה. הערה: רק האזור הנבחר יסרוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את המדידה בזמן ניטור הערוץ הירוק באמצעות רק 488 ננומטר לייזר להפעיל GFP. ודא כי עוצמת הלייזר 488 הוא נמוך יחסית (~ 1%). למדוד את עוצמת הממוצע של ה- GFP באזור של עניין על ידי בחירת &quot;מדוד&quot; | &quot;מדידת זמן&quot;. השתמש בכרטיסיות &quot;גרף&quot; או &quot;נתונים&quot; כדי לעקוב אחר ערכי העוצמה הממוצעת בתוך החזר ה- ROI. הערה: שיעור הרכישה מוגדר על ידי זמן לשכון פיקסל וגודל החלון המלבני שנקבע בשלב 3.9, אבל באופן כללי, זה מאפשר ניטור מהיר של האות (~ 2-10 מסגרות / ים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום נזק לתאי הכליה עם לייזר סגול (405 ננומטר) על ידי הגדלת עוצמת 100% על ידי הזזה של &quot;כוח לייזר&quot; שליטה כל הדרך ימינה. לייזר 488 ננומטר יכול להישאר פעיל אם עוצמת נמוכה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לקו gRaph באמצעות הכרטיסייה &quot;גרף&quot; או את הערכים המספריים של עוצמת ה- GFP באמצעות הכרטיסייה &quot;נתונים&quot; ולחכות עד טיפות לרמה הרצויה, למשל 50% של הבסיס (כפי שמוצג בתרשים 1 ). הערה: נעשה שימוש בלייזר 20 מגה-וולט כחלק מיחידת הלייזר שאליה מתייחסת (ראה טבלת החומרים ); העוצמה המקסימלית עשויה להשתנות בין מערכות. בעצימות נמוכה ניתן לפצות על ידי חשיפה ארוכה יותר ( כלומר באמצעות הלבנת GFP אחוזים כאמצעי החשיפה הכוללת). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עוצמת ה- GFP בתוך ההחזר על ההשקעה אליפטי (שלב 3.8) ירד לרמה הרצויה, מיד להפחית את עוצמת הסגול (405 ננומטר) לייזר ל &quot;0&quot; על ידי הזזת המחוון &quot;לייזר כוח&quot; כל הדרך שמאלה ב לוח הבקרה של התוכנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השגת בסיס חדש של הקרינה GFP. לאשר את אבלציה על ידי קבלת יחס של X / Y. הערה: ראה איור1B; Y = האינטנסיביות הממוצעת לפני האבלציה ו- X = האינטנסיביות הממוצעת לאחר האבלציה, תוך שימוש בממוצע של 4 דגימות עוקבות בתוך החזר ה- ROI. יחס היעד המדויק (50%, 60% וכו &#39; ) תלוי בכמות הפגיעה הרצויה לניסוי נתון. </li></ol></li></ol> 4. זמן לשגות מיקרוסקופית עם מכתים יודיד Propidium <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל שיקולים כללי זמן לשגות (שתוארו במחקר קודם 15 ) כדי לדמיין מכתים propidium יודיד כקורלציה של פגיעה בתאי כליות לאחר photoablation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לדגור את הזחלים ב 30 מיקרומטר propidium iodide פתרון (1% DMSO ב E3-PTU) במשך 3 שעות לפני הטבעה ו photoablation, כמתואר בשלבים 2 ו 3.7, בהתאמה. הערה: אין propidium יודיד נוסף נדרש agarose או פתרון הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר פגיעה בכליות קטועי, כפי שמתואר בשלבים 3.1-3.12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג זמן לשגות ערימות תמונה, כמו descriבמיטה במחקר קודם 14 , באמצעות לייזר 488 ננומטר (GFP) ו 461 ננומטר לייזר (Propidium יודיד, PI). הערה: שני הצבעים הם על גבי ערימות confocal לקשר את היעלמותו של ה- GFP ואת המראה של מכתים יודיד propidium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הפרמטרים להשגת ערימת זמן לשגות התמונה כדלקמן: עובי פרוסה וירטואלית = 4 מיקרומטר, z- מחסנית מרווח = 2 מיקרומטר, פיקסל לשכון זמן = 1.9 μs, ממדי תמונה = 512 x 512, ו ממוצעים = 2. הערה: פרמטרים אלה מאפשרים רציף, 10-15 דקות הקלטה של ​​עד 4 הזחלים ולוודא שיש photobleaching מינימלי של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת הדמיה תואם עם פורמט קובץ ההקלטה כדי לדמיין ולנתח את הנתונים. </li></ol>

<ol>
	<li>Chertow, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Kidney+Injury,+Mortality,+Length+of+Stay,+And+Costs+In+Hospitalized+Patients.">Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+And+Clinical+Outcomes+of+Acute+Kidney+Injury+Requiring+Renal+Replacement+Therapy+In+Japan.">Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan.</a> Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).</li><li>Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis,+Epidemiology+And+Outcomes+of+Acute+Kidney+Injury.">Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).</li><li>Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Kidney+Injury.">Acute Kidney Injury.</a> The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).</li><li>Esson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+And+Treatment+of+Acute+Tubular+Necrosis.">Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis.</a> Ann Intern Med. 137 (9), 744 (2002).</li><li>Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+Acute+Kidney+Injury.">Biomarkers of Acute Kidney Injury.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).</li><li>Hentschel, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Renal+Failure+In+Zebrafish:+A+Novel+System+To+Study+A+Complex+Disease.">Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li><li>Cianciolo Cosentino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Microinjections+of+Zebrafish+Larvae+To+Study+Acute+Kidney+Injury.">Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Ablation+of+The+Zebrafish+Pronephros+To+Study+Renal+Epithelial+Regeneration.">Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li><li>Drummond, I. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Kidney+Development.">Zebrafish Kidney Development.</a> Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).</li><li>Toback, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+After+Acute+Tubular+Necrosis.">Regeneration After Acute Tubular Necrosis.</a> Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).</li><li>Witzgall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Proliferating+Cell+Nuclear+Antigen,+Vimentin,+C-Fos,+And+Clusterin+In+The+Postischemic+Kidney.+Evidence+For+A+Heterogenous+Genetic+Response+Among+Nephron+Segments,+And+A+Large+Pool+of+Mitotically+Active+And+Dedifferentiated+Cells.">Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells.</a> J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).</li><li>Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiation+And+Proliferation+of+Surviving+Epithelial+Cells+In+Acute+Renal+Failure.">Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).</li><li>Palmyre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+Drives+Kidney+Repair+After+Acute+Injury.">Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury.</a> PLoS ONE. 9 (7), e101304 (2014).</li><li>Vasilyev, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+Kidney+Development+In+Zebrafish.">Live Imaging Kidney Development In Zebrafish.</a> Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).</li><li>Korzh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Compound+Transgenic+Zebrafish+In+Development:+A+Tale+of+Green+Fluorescent+Protein+And+Killerred+.">Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred .</a> Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).</li><li>Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+comparative+expression+analysis+of+a+second+wt1+gene+in+zebrafish.">Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish.</a> Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).</li><li>Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros.">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).</li><li>Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebra+fish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish.</a> Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).</li><li>Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+RET+regulatory+function+from+human+to+zebrafish+without+sequence+similarity.">Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity.</a> Science. 312 (5771), 276-279 (2006).</li><li>Seiler, C., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+labeling+of+the+zebrafish+pronephric+duct+and+tubules+using+a+promoter+from+the+enpep+gene.">Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene.</a> Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).</li><li>Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).</li><li>Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+transgenic+Enhancer+TRAP+line+database+(ZETRAP).">Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP).</a> BMC Dev Biol. 6 (1), 5 (2006).</li><li>Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+to+identify+developmentally+regulated+zebrafish+genes+in+vivo.">Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo.</a> Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

יש לציין כי כוח הלייזר הכולל משתנה בין מערכות. עם זאת, באמצעות אחוזים gob photobleaching מאפשר readout של האנרגיה הכוללת נמסר כליה ניאון, עצמאית של וריאציה לייזר כוח פיצוי על ידי אורך החשיפה. יש לזכור, עם זאת, כי התגובה של רקמות שונות בשיטה זו של photoablation משתנה. גם במהלך התבגרות הכלי?...

פגיעה חריפה בכליות (AKI) , 1 , 2 , אשר גם יכול להיקרא אי ספיקת כליות חריפה, מוגדר באופן כללי כמו ליקוי פתאומי בתפקוד הכליות 3 . בעוד שרמת ההבנה של מצב זה שופרה במידה ניכרת לאורך השנים, שיעורי התחלואה והתמותה נותרו גבוהים , 1 , 2 . הטיפול הנוכחי במצב זה הוא בעיקר תומך, כמו תוצאות של ניסויים קליניים מרובים של טיפול תרופתי כבר שלילי 4 , 5 . הכליה היא ייחודית בכך שיש לה את היכולת לתקן את עצמה. לכן, טיפול תומך לאחר אבחון מוקדם של AKI הוא הדרך הטובה ביותר להגביל את התחלואה 6 . עם זאת, קשה לזהות AKI מוקדם, ושיעור התמותה הוא מדהים 50-80% עבור אלה הזקוקים לדיאליזה 5. עם היכולת של הכליות לתקן את עצמם ואת חוסר אפשרויות הטיפול עבור מצב זה, חשוב לפתח שיטות כדי לשפר את תהליך התחדשות נפרון. היו הרבה מודלים שונים המשמשים במחקר AKI הכולל סוכנים שונים של פגיעה ומודלים של בעלי חיים. במונחים של סוכנים של נזק לכליות, aminoglycoside גנטמיצין אנטיביוטי שימש כסוכן nephrotoxic שמוביל AKI 7 , 8 . עם זאת, מספר קבוצות מצאו כי טיפול גנטמיצין הוא קטלני העובר דג הזברה 9 . זה גורם נזק צינורי כי הוא רציני מדי עבור התאוששות העובר, מה שהופך את המחקר של התחדשות קשה ללא סוג כלשהו של התערבות. מודלים יונקים, כמו העכבר חולדה, נחשבים גם בעלי ערך, אבל הם עומדים בפני מגבלות רבות במהלך המחקר של AKI. אולי החיסרון העיקרי של מודלים מכרסמים הוא הקושי visuaLizing את הכליה מכרסם ובכך לקבוע את התהליכים spatiotemporal מדויק המוביל מוות ותיקון אפיתל. Johnson et al. דיווחו לייזר לייזר טכניקה מבוססת כדי לגרום פגיעה בכליות חריפה של דג הזברה עובריים 9 הזחל. הם השתמשו אבלציה לייזר פעמו לפגוע בכליה לאחר הזרקת שריר עם הצמד דקסטרן. הקרינה מן מצמידים dextran מאפשר הדמיה של נזק התחדשות אפיתל 9 אבובית. מודל זה מתגבר על שתי המגבלות שהוזכרו לעיל, אך הוא אינו מאפשר רמות מוגדרות של פגיעה וקשה לבצע על קבוצות תאים שרירותיות גדולות. החדש לייזר אבלציה מבוסס מודל דג הזברה של AKI המתואר כאן כתובות כל המגבלות לעיל. הכליה pronephric בזברה דג הזחל הוא איבר מבוגר, מתפקד המכיל קטעים דומים יונקים nePhron, כולל גלומרולוס, tubules פרוקסימלי ודיסטלי, וכן צינור איסוף 10 . הזחלים דג הזברה הם גם שקופים אופטית, מה שהופך אותו ריאלי לצפות בכליות באמצעות טכניקות הקרינה. לכן, דג הזברה הם בעלי ערך במודל vivo של AKI, ואת הכליה pronephric הזחל (5-12 ימים לאחר הפריה (dpf)) ניתן להשתמש כדי ללמוד את התהליכים הסלולר המולקולרי מעורב פגיעה בכליות ותיקון. מאמר זה מציג שיטה שבאמצעותה חלבונים ספציפיים של חלבונים ירוקים (GFP) של נפרון יכולים להיות מצולמים באמצעות מערכת אנרגיית אור נמוכה (בהשוואה למערכת לייזר פולס), אור לייזר סגול (405 ננומטר). הקרינה GFP מאפשר מיקוד של קבוצה של תאים, מה שהופך את השינויים המתרחשים גלוי דרך תצפית של photobleaching GFP. בנוסף, GFP (על ידי קליטת אור סגול) משמש כיור אנרגיה כדי potentiate הפציעה GFP- להביע תאים כליות. זמן לשגות microsעותק ואז ניתן להשתמש כדי ללמוד את תהליך התיקון. מחקרים מצאו התפשטות תאים, הגירה תא, metaplasia התא 11 , 12 , 13 להיות כל התהליכים הפוטנציאליים שעשויים לשחק תפקיד חשוב לתיקון הכליות. עם זאת, את החשיבות היחסית של תהליכים אלה ואת הפרטים של גומלין שלהם היה קשה לחשוף בשל מגבלות של מודלים קיימים של AKI. באמצעות גישה חדשה זו, ניתן היה להראות כי הגירה תא ממלא תפקיד מרכזי לתיקון כליות לאחר פגיעה חריפה 14 .

<table><tbody><tr><td>Petri Dishes, 35 x 10 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td>Procedural Usage: Step 2.4, 2.7</td></tr><tr><td>Petri Dishes, 100 x 15 mm</td><td>Midwest Scientific</td><td>910</td><td>Procedural Usage: Step 1</td></tr><tr><td>Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar</td><td>Fischer Scientific</td><td>50-241-57</td><td>Procedural Usage: Step 2.1.1</td></tr><tr><td>Plastic Transfer Pipet</td><td>Globe Scientific</td><td>135030</td><td>Procedural Usage: Step 2.5, 3.6</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Procedural Usage: Step 2.3, 3.4</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Procedural Usage: Step 2.3</td></tr><tr><td>Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-1640-2C</td><td>Procedural Usage: Step 2.4</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td>Procedural Usage: Step 1.5</td></tr><tr><td>SOLA Light Engine</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM-5-LCR-SB</td><td>Procedural Usage: Step 1.5</td></tr><tr><td>Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System</td><td>Nikon</td><td></td><td>Procedural Usage: Step 3</td></tr><tr><td>1x E3 Solution</td><td></td><td></td><td>Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; , 0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3</td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2</td></tr><tr><td>NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td>C2+</td><td>Procedural Usage: Step 3</td></tr><tr><td>Laser Unit</td><td>Agilent</td><td>MLC 400</td><td>Procedural Step 3.11</td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170-100MG</td><td>Procedural Step Usage: 4.2</td></tr></tbody></table>

precise cellular ablation approach for modeling acute kidney injury in developing zebrafish

פגיעה חריפה בכליות (AKI) היא מצב רפואי נפוץ עם שיעור תמותה גבוה. עם יכולות התיקון של הכליה, ניתן לשחזר תפקוד כליות נאות לאחר טיפול תומך. עם זאת, הבנה טובה יותר של איך המוות נפרון התא והתיקון מתרחשים ברמה התאית נדרש כדי למזער את המוות התא כדי לשפר את תהליך התחדשות. דג הזברה pronephros היא מערכת מודל טוב כדי להשיג מטרה זו משום שהיא מכילה קטעים אנטומיים הדומים נפרון יונקים. בעבר, המודל הנפוץ ביותר המשמש לחקר פגיעה בכליות בדגים היה מודל גנטמיצין פרמקולוגי. עם זאת, מודל זה אינו מאפשר שליטה מדויקת spatiotemporal של פגיעה, ולכן קשה ללמוד תהליכים תאיים ומולקולריים המעורבים תיקון כליות. כדי להתגבר על מגבלה זו, עבודה זו מציגה שיטה שבאמצעותה, בניגוד לגישה של ג&#39;נטמיצין, חלבונים מסוימים של פרוטאינים ירוקים (GFP)לחיצה על קטע נפרון יכול להיות photablated באמצעות אור לייזר סגול (405 ננומטר). זה מודל חדשני של AKI מספק יתרונות רבים כי שיטות אחרות של פציעה אפיתל חסר. היתרונות העיקריים שלו הם היכולת &quot;לחייג&quot; את רמת הפציעה ואת השליטה המדויקת spatiotemporal חזקים מודל חיות vivo . שיטה חדשה זו יש פוטנציאל לקדם באופן משמעותי את רמת ההבנה של פגיעה בכליות מנגנוני תיקון.

שים לב כי פרוטוקול זה שימש בהצלחה עם מספר קווי Ghen כליה מהונדסים, כולל ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10, ו Tg (atp1a1a.4: GFP). תוצאות הדוגמה המוצגות כאן התקבלו באמצעות ET (krt8: EGFP) sqet11-9 שורה. איור 1</str...

Watch this Scientific Journal Video about Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish at JoVE.com

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

עבודה זו מציגה מודל חדש של vivo של פגיעה בכליות קטועי באמצעות דג הזברה הכליה GFP כליה. המודל מאפשר אינדוקציה של אבלציה ממוקד של תאים כלית אפיתל להראות את המנגנונים הסלולר של פגיעה נפרון ותיקון.

גישה אבולרית מדויק עבור דוגמנות פגיעה בכליות חריפה בפיתוח דג הזברה

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

precise-cellular-ablation-approach-for-modeling-acute-kidney-injury

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K Views.  NYITCOM.  עבודה זו מציגה מודל חדש של vivo של פגיעה בכליות קטועי באמצעות דג הזברה הכליה GFP כליה. המודל מאפשר אינדוקציה של אבלציה ממוקד של תאים כלית אפיתל להראות את המנגנונים הסלולר של פגיעה נפרון ותיקון. 

Video: Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biology

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

השתלה של תאים ישירות לתוך הכליה של דג הזברה למבוגרים

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

מודל פגיעה בכליות חריפה המושרה על ידי ציספלטין בדג זברה למבוגרים

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Medicine

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Intravenous Microinjection of Nephrotoxins into Zebrafish Embryo: A Technique to Deliver Nephrotoxic Agents into the Bloodstream of Zebrafish Embryo

Source: McKee, Robert A. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/54241" target="_blank">Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the intravenous microinjection of nephrotoxins into the tail vein of a zebrafish embryo to study their chemical effects on renal function.

מיקרו-הזרקה תוך ורידית של נפרוטוקסינים לעובר דג זברה: טכניקה להעברת חומרים נפרוטוקסיים לזרם הדם של עובר דג זברה

Source: McKee, Robert A. et al. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the ...